66ª Reunião Anual da SBPC

Resumo aceito para apresentação na 66ª Reunião Anual da SBPC pela(o): SBTx - Sociedade Brasileira de Toxinologia

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Bioquímica

Caracterização bioquímica de uma PLA2-homóloga a partir do veneno da vespa social Polybia occidentalis

RAFAELA DINIZ SOUSA - Doutoranda / Universidade Federal de Rondônia - UNIR e Membro do CEBio / FIOCRUZ-RO EDAILSON DE ALCÂNTARA CORRÊA - Doutorando / Rede BIONORTE e Membro do CEBio / FIOCRUZ-RO RODRIGO SIMÕES SILVA - Doutorando / Rede BIONORTE e Membro do CEBio / FIOCRUZ-RO MARTA CHAGAS MONTEIRO - Pesquisadora / Faculdade de Farmácia / Universidade Federal do Pará – UFPA ANDERSON MAKOTO KAYANO - Orientador/ Pesquisador do CEBio / FIOCRUZ-RO

INTRODUÇÃO:

Os venenos de himenópteros são constituídos por uma mistura complexa de substâncias biologicamente ativas, que incluem aminas, pequenos peptídeos e proteínas de alta massa molecular. Esses venenos são responsáveis pelos principais casos de reações alérgicas em indivíduos previamente sensibilizados, devido à liberação de substâncias desencadeadoras de hipersensibilidade imediata como serotonina, histamina, prostaglandina e leucotrieno. Os principais alérgenos encontrados nos venenos de vespas são fosfolipases A1 e A2, antígeno 5, hialuronidases e proteases. As fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas capazes de promover a hidrólise da ligação éster na posição sn-2 dos fosfolipídios, produzindo ácido graxo (ácido araquidônico) e lisofosfolipídio. O ácido araquidônico quando liberado pode ser precursor dos eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), que estimulam inúmeros processos inflamatórios. As caracterizações bioquímica e farmacológica desses componentes podem estabelecer novos parâmetros para o diagnóstico e o tratamento das reações alérgicas que acompanham os acidentes por himenópteros.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Caracterizar bioquimicamente uma fosfolipase A2 (PLA2) do veneno da vespa Polybia occidentalis.

MÉTODOS:

O veneno bruto de Polybia occidentalis foi fracionado em duas etapas cromatográficas: Exclusão Molecular (ME) e Fase Reversa (RF). Na primeira etapa, o veneno de P. occidentalis foi submetido à cromatografia de ME com a coluna Sephacryl S-200 (10x30 cm), utilizando como tampão Bicarbonato de amônio 50 mM, pH 8,0, sob o fluxo de 1 mL/min. As frações coletadas foram congeladas, liofilizadas e testadas quando sua atividade fosfolipásica sobre o substrato 4-nitro-(3-otanoiloxi) benzóico (4N3OBA). Na segunda etapa, as frações de interesse foram recromatografadas separadamente em coluna de fase reversa C18 Discovery (25 cm; 4.6 mm e 5µm) pré-equilibrada com ácido tricloroacético (TFA) 0,1% (Eluente A), com gradiente linear de 0-70% de acetonitrila (ACN) 99,9% + TFA 0,1% (Eluente B) e fluxo de 1 mL/min. Em seguida, realizou-se eletroforese monodimensional (1D SDS-PAGE) dos picos obtidos, no qual foi observada uma banda proteica de aproximadamente 14 kDa com alto grau de pureza. Após eletroforese bidimensional, comprovou-se a pureza da proteína e esta foi sequenciada pelo método de Degradação de Edman.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Na cromatografia de ME foram obtidas 10 frações, denominadas PoS-1 a PoS-10, respectivamente. Cada fração foi testada quanto sua atividade fosfolipásica sobre o substrato 4N3OBA, onde se verificou que as frações PoS-1, PoS-2, PoS-3 e PoS-4 foram ativas para esse substrato. Após eletroforese monodimensional 1D SDS-PAGE, observou-se que as massas moleculares relativas variavam de 14 a 60 kDa. Logo, cada fração foi recromatografada em coluna de RF com a obtenção de 03 picos (P1, P2 e P3), dos quais o pico 1 (P1), após 1D SDS-PAGE, apresentava uma única banda proteica de aproximadamente 14 kDa com alto grau de pureza. Essa proteína, que não apresentou atividade fosfolipásica considerável, teve seus primeiros 58 resíduos de aminoácidos da região N-terminal sequenciados pelo método de Degradação de Edman, obtendo-se: SLFELEGKMILQETGKNPAKSYGVYGCNCGVGGRGKPKDA TDRCCYVHKCCYKKLTGC. O alinhamento múltiplo revelou 98%, 95% e 51% de identidade com fosfolipases A2 homólogas (PLA2-Lys49) dos venenos de Bothrops moojeni, B. asper e B. leucurus e com uma proteína não caracterizada de Nasonia vitripennis (Vespidae), respectivamente, demonstrando que esta proteína ainda não havia sido purificada do veneno de Polybia occidentalis, e que sua similaridade com PLA2-homólogas de serpentes do gênero Bothrops pode evidenciar a importância dessas enzimas nas alterações fisiopatológicas desencadeadas durante o processo de envenenamento.

CONCLUSÕES:

Os venenos de vespas são constituídos por uma variedade de compostos biologicamente ativos, que podem desencadear em indivíduos sensibilizados reações alérgicas intensas. Entre os principais alérgenos, as fosfolipases A (A1 e A2) compõem “a chave” dos processos inflamatórios por estarem envolvidas direta ou indiretamente na síntese de eicosanoides. A purificação e a caracterização bioquímica de PLA2 do veneno de Polybia occidentalis são primordiais para se evidenciar os possíveis mecanismos de ação empregados durante o envenenamento, bem como para se propor novas alternativas de diagnóstico e/ou tratamento.

Palavras-chave: Venenos de himenópteros, Polybia occidentalis, Fosfolipase A2 do veneno de vespas.