65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 10. Microbiologia - 2. Microbiologia Aplicada

SELEÇÃO DE Bacillus thuringiensis COM ATIVIDADE TÓXICA PARA Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) NO ESTADO DO Tocantins

Antônio Carlos Costa Ramos - Acadêmico do Curso de Engenharia Agronômica, UFT Patrícia Verdugo Pascoal - Acadêmica do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, UFT Giselly Batista Alves - Acadêmica do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, UFT Raimundo Wagner de Souza Aguiar - Departamento de Ciências Agrárias e Tecnológica – UFT

INTRODUÇÃO:

A dispersão do mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Díptera: Culicidae) nos centros urbanos está associada às condições ambientais, climáticas e sociais as quais favorecem a proliferação do mosquito (COX et al., 2007). Nos últimos anos, alguns estados brasileiros vêm passando por graves epidemias de vírus da dengue, principalmente, devido à ineficiência dos métodos de controle utilizados no combate deste inseto vetor do vírus (CHANG et al., (2009). A descoberta da bactéria de solo Gram positiva B. thuringiensis, principalmente a var. israelensis (H-14), possibilitou o desenvolvimento de biolarvicidas promissores para o controle de larvas de mosquitos vetores de doenças tropicais (RAYMOND et al., 2010). A toxicidade está associada à δ-endotoxinas produzidas durante a fase de esporulação (DE MAAGD et al., ( 2003). Atualmente, diversas proteínas cry possuem toxicidade para dípteros Cry4Aa, Cry4Ab, Cry10Aa, Cry11Aa, Cry11Ba, Cyt1Aa e Cyt1Ab (CRICKMORE et al., 2009). No entanto, as interações de proteínas podem afetar a toxicidade de um isolado; assim, a caracterização dos genes presentes nas estirpes pode sugerir potencial na toxicidade contra os insetos-alvo e obtenção de diferentes toxinas com atividade tóxica para Aedes aegypti.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Selecionar e identificar estirpes de B. thuringiensis com atividade tóxica para Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) no estado do Tocantins.

MÉTODOS:

Neste trabalho, 43 isolados de B. thuringiensis foram caracterizados por PCR utilizando iniciadores específicos para genes cry e cyt que codificam para proteínas ativas contra insetos da ordem Diptera. Foram realizados bioensaios para larvas de 1º/2º estágio de Aedes aegypti em triplicata a partir de diluições seriadas do caldo bacteriano obtido conforme a metodologia utilizada por Monnerat et al. (2001). A extração de DNA plasmidial do B. thuringiensis foi realizada de acordo com os procedimentos utilizados por Monerrat et al. (2001). Para confirmação da presença dos genes cry e amplificação do gene cry11Aa, foi realizada reação de PCR consistindo de 50 ng de DNA, oligonucleotídeos (0.4 µM de cada) específicos para a detecção dos genes cry ativos para dipteros, 10 µM de cada DNTP, 2,5 μL de tampão de Taq DNA polimerase, MgCl2 2mM e 1U de Taq polimerase em um volume total de 50 μL. A amplificação foi realizada de acordo com os seguintes passos: 94°C/5 min em seguida por 30 ciclos em 95°C/30 s, 52°C/1,30 s, 72°C/4 min e a extensão final de 72°C/8 min. Após os resultados obtidos das reações de PCR, o gene cry11 foi clonado no vetor pGem® Teasy e enviado para sequenciamento automático.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Resultado de amplificação para as 43 linhagens selecionadas quanto aos genes que são específicos contra insetos da ordem Diptera. Todos os isolados caracterizados geneticamente apresentaram amplificação para os genes, cry4A, cry4B, cry10, cry11 e cyt1 e cyt2 . Este complexo gênico pode explicar a toxicidade apresentada pelos isolados testados. A ação letal determinada para os dois isolados de B. thuringiensis obtidos em bioensaios é comparativa aos encontrados para o IPS 82, base para a síntese de produtos comerciais. A partir das estirpes promissoras, um fragmento correspondente ao gene cry11Aa (2.042 pb) foi clonado dentro do vetor de clonagem pGem®-T easy e sequenciado. A análise de BLAST mostrou que o gene cry11Aa obtido tem 100% de identidade com o gene cry11Aa descrito por Berry et al. (2002). (número de acesso no Genbank = YP_001573776). Em alguns estudos a toxina CRY apresenta maior toxicidade em Aedes aegypti, A. stephensi e C. pipiens, também têm sido reportadas agindo por sinergismo (BRAVO et alB. thuringiensis na toxicidade para larvas de Aedes aegypti.

CONCLUSÕES:

- Nos isolados de B. thuringiensis selecionados com atividade tóxica para Aedes aegypti, foram identificados genes cry característicos das toxinas conhecidas contra o mosquito e apresenta alta potencialidade para estudos de bioprospecção de novos biolarvicidas. - O gene cry11Aa foi idêntico à sequência de outros os genes cry11Aa, já descritos na literatura por outros autores.

Palavras-chave: Larvicida, Mosquito, cry11Aa.