65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 9. Imunologia - 5. Imunologia

ANÁLISE COMPARATIVA DO RECONHECIMENTO IMUNE DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DERIVADAS DO DOMÍNIO III DA PROTEÍNA E DO VÍRUS DENGUE (DENV-1-2 e 3).

Isabel Desidério Braquehais - Centro de Ciências da Saúde - UECE Tatiane Rodrigues de Oliveira - Profa. Dra. - Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) Sergio Rodriguez Málaga - Prof. Dr. - Universidade Federal do Pará Silmaria Celestino Costa Santos - Centro de Ciências da Saúde - UECE Maria Izabel Florindo Guedes - Profa. Dra.Orientadora - Centro de Ciências da Saúde - UECE

INTRODUÇÃO:

A dengue é uma doença infecciosa aguda ocasionada por vírus pertencente ao grupo B dos arbovírus, transmitida ao homem através da picada da fêmea de mosquitos hematófagos Aedes aegypti. A ausência de controle dos vetores, tratamento inespecífico e ausência de uma vacina que proteja contra os 4 sorotipos, são responsáveis pelo aparecimento de novos casos e evolução para casos graves. Atualmente, os testes sorológicos para dengue, não são capazes de diagnosticar o sorotipo viral e a diferenciação entre infecção primária e secundária de forma rápida, fatores importantes para monitoração de epidemias e para identificação dos riscos de casos de febre hemorrágica e complicações do dengue.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este estudo teve como objetivo a expressão em Escherichia coli de proteínas recombinantes correspondentes à região variável do domínio III da proteína E dos sorotipos 1, 2 e 3, avaliar e comparar o reconhecimento com anticorpos presentes em soros de indivíduos diagnosticados com a doença.

MÉTODOS:

As proteínas de fusão a His6 produzidas em sistema bacteriano expressaram-se na forma insolúvel o que necessitou de solubilização por uréia e processo de “refolding” através da retirada do agente denaturante durante a purificação em coluna de afinidade contendo Ni2+. A detecção de anticorpos IgM e IgG anti-EDIII foi feita por ELISA conforme descrito por Oliveira et al, (2008). As frequências de respondedores obtidas nos ensaios sorológicos foram comparadas pelo teste qui-quadrado (χ2) em tabelas de contigência (2x2), com correção de Yates (GraphPad Prism 5.0). Os valores de DO492 obtidos contra as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas pelo teste estatístico Kruskal-Wallis utilizando o programa GraphPad Prism 5.0. O valor estatístico significativo usado foi p<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Com o objetivo de avaliar comparativamente o reconhecimento imune das proteínas His6- EDIII-D1, 2 e 3 por anticorpos IgM e IgG, um total de 58 amostras de soros coletadas de indivíduos durante a infecção patente, procedentes de diferentes áreas endêmicas do Estado do Ceará, foram analisados por ELISA. A frequência de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM contra cada uma das proteínas foi de 1,7%, 34,5% e 24,1% para His6-EDIII1, 2 e 3, respectivamente. Observamos que a proteína correspondente ao sorotipo 1 foi reconhecida por uma fração significativamente menor de indivíduos em relação as demais proteínas (p>0,05). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa na proporção de soros que reconhecem as proteínas His6-EDIII2 e 3 (p>0,05). Enquanto que a frequência de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG contra cada uma das proteínas testadas foi de: His6-EDIII1=51,7%, His6-EDIII2=82,7% e His6- EDIII3=100%. A análise estatística revelou que a proporção de indivíduos respondedores para a proteína recombinante His6-EDIII1 foi significativamente menor do que as proporções obtidas para His6-EDIII2 e 3 (p<0,05). Por outro lado, a proporção de indivíduos respondedores para His6- EDIII3 foi significativamente maior do que as obtidas para His6-EDIII1 e 2 (p<0,05).

CONCLUSÕES:

Nosso teste foi capaz de confirmar: (i) a expressão das proteínas recombinantes com peso molecular aparente de 20kDa; (ii) a integridade estrutural das proteínas através do reconhecimento por anticorpo monoclonal anti-His6, (iii) o reconhecimento dessas proteínas por anticorpo de pacientes infectados com dengue; (iv) diferenciação entre os sorotipos avaliados e (v) caracterização entre infecções primárias e secundárias.

Palavras-chave: Proteínas recombinantes, Dengue, Resposta imune.