65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIÁVEIS GÊNICAS DE CFTR DE PACIENTES PEDIÁTRICOS DO HUPAA/UFAL ATRAVÉS DE TÉCNICAS MOLECULARES

Dandara Maria Barbosa Mello Ruffier - Curso de Ciências Biológicas – ICBS/UFAL Renato Santos Rodarte - Prof./Orientador – Setor de Biologia Celular e Molecular – ICBS/UFAL

INTRODUÇÃO:

A Fibrose cística (FC) é uma doença congênita, autossômica recessiva, determinada pelo gene CFTR que regula e codifica um canal iônico, o canal de cloro. Mutações neste gene geram desregulação desse canal, com consequente desequilíbrio eletrolítico e mau funcionamento das glândulas exócrinas. O fenótipo da FC é altamente variado, sendo este determinado pela heterogeneidade alélica apresentada por cada indivíduo, pela ação de genes modificadores e efeitos ambientais. O CFTR possui, até o momento, 1.937 mutações identificadas, sendo a mutação F508del a mais frequente entre os pacientes com FC. No Brasil, o gene CFTR apresenta uma grande diversidade alélica devido à miscigenação, logo a frequência das mutações varia de estado para estado. No Estado de Alagoas há o registro de 26 indivíduos diagnosticados com fibrose cística, assistidos no Hospital Universitário Professor Alberto Antunes (HUPAA) onde recebem diagnóstico (via testes bioquímicos) e tratamento clínico. No entanto, não há um serviço de diagnose molecular, fundamental à confirmação da doença, esclarecimento de casos duvidosos, identificação das mutações no gene e, principalmente, para a caracterização das variáveis gênicas presentes no Estado.

OBJETIVO DO TRABALHO:

I. Avaliar o perfil das mutações de pacientes pediátricos portadores de FC do HUPAA; II. Verificar a incidência/frequência de pacientes FC em Alagoas comparados a outros estados e países; III. Analisar a incidência de doenças associadas aos pacientes FC, além das relatadas; IV. Padronizar e validar a técnica ASO no laboratório.

MÉTODOS:

As amostras analisadas foram obtidas no ambulatório de pediatria do HUPAA/UFAL, sob os cuidados da Profª. Drª. Maria Viviane Lisboa Vasconcelos e da Drª. Katharina Moura, após o devido consentimento do paciente e/ou responsável com a assinatura do TCLE. Foram analisados um total de 16 amostras, sendo 13 de pacientes FC (diagnosticados clinicamente através dos sintomas mais frequentes e teste do suor) e três controles (voluntários). A identificação das mutações ΔF508, G542X, N1303K, R1162X, R334W, W1282X seguiu os seguintes passos: i) amostras de sangue foram separadas em alíquotas e estocadas a -20ºC; ii) extração do DNA genômico de acordo com o kit Flexigene (Qiagen); iii) quantificação em 260 nm e 280 nm por espectrofotometria e iv) conservação do DNA genômico de cada paciente e voluntário em alíquotas a -20°C. A metodologia introduzida e validada para detecção das variantes e dos controles foi referente à técnica ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide Amplification). Os amplicons foram fracionados em gel de agarose 2% em solução de TBE 0,5%, corado em brometo de etídio e posteriormente fotografado através do sistema de captura de imagem ECX-20M, Vilber lourmat, France.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Os primers foram construídos a partir de regiões especificas do CFTR, de acordo com suas incidências em diferentes estados brasileiros e com o auxílio de bancos de dados (Genebank e Cystic Fibrosis Mutation Database). Os aplicativos Oligo Explorer e Oligo Analyzer foram utilizados para definir as sequências e as características físico-químicas de cada primer. Através da técnica utilizada, 12 dos 26 alelos mutantes nos 13 pacientes incluídos neste estudo foram identificados. Seis pacientes (46,15%) tiveram o genótipo definido e apenas dois destes apresentou uma mutação em apenas um dos alelos. As mutações encontradas foram: F508del (0,3%), G542X (0,077%), W1282X (0,038%). Todos os pacientes apresentaram diagnóstico negativo para a mutação R334W e as mutações R1162X e N1303K exibiram problemas de amplificação.

CONCLUSÕES:

O presente estudo permitiu: i) Correlacionar o fenótipo com as mutações descritas para o CFTR; ii) conhecer a identidade genética de cada paciente para auxiliar nos procedimentos terapêuticos; iii) possibilitará em futuros pacientes diagnosticados precocemente por meio de testes moleculares prever as possíveis manifestações clinicas que poderão apresentar e aplicar um tratamento individualizado e não padronizado; iv) permitiu a identificação de algumas mutações do CFTR presentes no estado de Alagoas e; v) a técnica escolhida e empregada (ASO-PCR) mostrou-se simples e eficiente na detecção de alterações no gene CFTR, apesar de não permitir avaliar todo o gene e sim apenas mutações pré-definidas pelo grupo.

Palavras-chave: Variações do CFTR, Diagnóstico Molecular, ASO-PCR.