65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

Análise do Secretoma do isolado PbEpm83 de Paracoccidioides brasiliensis

Amanda Rodrigues de Oliveira - Laboratório de Biologia Molecular / ICB II /UFG Simone Schneider Weber - Drª / Laboratório de Biologia Molecular / ICB II /UFG Célia Maria de Almeida Soares - Profª Drª / Laboratório de Biologia Molecular / ICB II /UFG Clayton Luiz Borges - Profº Drº / Orientador - Laboratório de Biologia Molecular / ICB II /UFG

INTRODUÇÃO:

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da (PCM), doença endêmica na América Latina (Restrepo e Tobon, 2005). O fungo cresce como micélio, forma infecciosa e saprobiótica, no ambiente em temperaturas inferiores a 28 ºC e como levedura, a 36 ºC no hospedeiro humano ou quando cultivado in vitro (Bagagli et al., 2006). A PCM é uma micose humana sistêmica granulomatosa adquirida usualmente pela inalação de propágulos do micélio (San-Blas et al., 2002). O secretoma representa cerca de 30% do proteoma de um organismo (Ranganathan et al., 2009). Proteínas secretadas por fungos apresentam importantes funções e podem estar direta ou indiretamente envolvidas no diálogo molecular com células do hospedeiro capacitando sua sobrevivência, multiplicação e disseminação (Silva et al., 2011). Diante da importância das proteínas secretadas nos mecanismos de interação parasito-hospedeiro nós realizamos este trabalho a fim de identificar proteínas secretadas no isolado PbEpm83 por meio de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas, que pudessem estar associadas à sobrevivência e patogenicidade fúngica nos tecidos do hospedeiro, corroborando com dados da literatura.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Este trabalho objetiva à análise e identificação do secretoma de P. brasiliensis, no isolado clínico PbEpm83,pertencente ao grupo filogenético PS3. Caracterização do perfil proteômico das proteínas secretadas, digestão tríptica de alguns spots e identificação destes por espectrometria de massas a fim de descrever mecanismos possivelmente relacionados à virulência do isolado.

MÉTODOS:

As células do isolado PbEpm83 de P. brasiliensis foram cultivadas em meio Fava-Netto sólido por 7 dias à 37ºC. Posteriormente as células foram inoculadas em meio Fava-Netto líquido e mantidas sob agitação por 24 horas à 36°C. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi submetido à filtração à vácuo em membranas de 0,45 μm e 0,22 μm. O filtrado foi concentrado e dosado pelo método de Bradford (Bradford,1976). Foi realizada a focalização isoelétrica do extrato, em triplicatas, em sistema IPGphor III(GE Healthcare) e então, submetidas à segunda dimensão em géis de poliacrilamida(2D-PAGE) usando um sistema vertical (GE Healthcare). Os géis foram corados e submetidos à análise de imagem pelo software Image Master 2D Platinum v 6.0 (GE Healthcare). As proteínas de interesse foram removidas manualmente e submetidas à digestão tríptica e subsequente identificação por espectrometria de massas (MS/MS). As proteínas foram identificadas utilizando o aparelho SYNAPT Q-TOF (Waters®) e a pesquisa no NCBI usando dados MS/MS foi realizada pelo software Mascot. As proteínas identificadas foram classificadas em categorias funcionais e submetidas à análises adicionais em softwares de bioinformática para busca por mecanismos de secreção envolvidos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

Foram identificadas 46 proteínas/isoformas no isolado em estudo. A maioria das proteínas secretadas por P. brasiliensis, foi agrupada na categoria de Resgate celular, Defesa e Virulência (RDV) e Energia, incluindo proteínas de defesa como chaperonas e foldases, as quais fazem parte da maquinaria de proteção das células contra estresses (Gupta et al., 2011). A partir de buscas na literatura foi possível fazer um breve levantamento sobre as proteínas identificadas e suas possíveis relações com a virulência fúngica ao colonizar o hospedeiro humano. Enolase, triose fosfato isomerase, proteína Y20, superóxido dismutase, Hsp70, peptidil-prolil cis-trans isomerases e formamidase merecem destaque. Proteínas secretadas por fungos desempenham importantes funções, tais como, obtenção de nutrientes, comunicação célula-célula, colonização do substrato, detoxificação do meio e interações ecológicas com potenciais competidores. Consequentemente o secretoma pode ser considerado como um compartimento biológico real, tendo um papel essencial na estratégia da infecção fúngica (Silva et al.,2011).

CONCLUSÕES:

A eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas possibilita a construção de um mapa de proteínas secretadas, as quais podem estar associadas à sobrevivência e patogenicidade fúngica nos tecidos do hospedeiro. Nossos resultados mostram que cerca de 70% das proteínas secretadas identificadas foram preditas como secretórias, sendo a maioria delas utilizando vias secretórias não-convencionais, de acordo com o (FSD) Fungal Secretome Database. Reforçando o fato de que, algumas proteínas, incluindo proteínas citosólicas, têm sido recorrentemente detectadas no meio extracelular por diferentes pesquisadores em diversas espécies fúngicas, desempenhando importantes papéis. Entre essas moléculas identificadas incluem-se enzimas antioxidantes, proteínas de choque térmico, proteínas relacionadas à captação de nutrientes, sinalização celular e adesinas. A disponibilidade de dados de secretoma para patógenos diversos, associada às ferramentas de bioinformática, possibilita o entendimento de interações patógeno-hospedeiro, disseminação fúngica nos tecidos do hospedeiro e estratégias de evasão do sistema imune, dados importantes para compreensão da biologia deste importante patógeno humano.

Palavras-chave: Virulência, Espectrometria de massas, Eletroforese bidimensional.