65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE DIFERENTES PROTOCOLOS PARA ISOLAMENTO DE CLOROPLASTOS E EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DE FOLHAS DE PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas)

Elton Pedro Nunes Pena - Bolsista PIBIC/PROPESQ, Depto. de Biologia - UFRPE Regina Elisabety Oliveira Folha - Depto. de Genética, Centro Ciências Biológicas - UFPE Juliana Maria de Souza - Depto. de Biologia - UFRPE Maria Francyellen Lima Tavares da Silva - Depto. de Biologia - UFRPE Maria Clara Pestana-Calsa - Profa. Dra./Coorientadora – Uninassau/PE Tercilio Calsa Junior - Prof. Dr./ Orientador, Depto. de Genética, Centro Ciências Biológicas - UFPE

INTRODUÇÃO:

O pinhão-manso (Jatropha curcas L.), que é um arbusto da família Euforbiaceae, que pode ser cultivado em solos com deficiência em nutrientes, acredita-se ser proveniente da América Central, sendo de fácil adaptação no Brasil. Apresenta várias utilidades desde recuperação de solos, produção de mel e por apresentar um alto teor lipídico, que se assemelha ao diesel, é útil para fabricação de biodiesel, este óleo é inicialmente sintetizado nos cloroplastos. Estas organelas apresentam material genético próprio, desta forma são capazes de sintetizar suas próprias proteínas, onde estas são responsáveis pela fotossíntese, a biossíntese de aminoácidos, e principalmente nas plantas oleaginosas a biossíntese dos ácidos graxos. Por apresentarem estas funções é necessário o estudo das proteínas cloroplastidiais através de uma ferramenta chamada proteômica cuja função é analisar as diversas proteínas e como elas se expressam em diferentes condições, desta forma são necessários protocolos eficientes para o isolamento de organelas, tais como o cloroplasto e extração destas proteínas, para desta forma analisar o proteoma vegetal e gerar melhorias a esta cultura.

OBJETIVO DO TRABALHO:

Analisar comparativamente diferentes protocolos para isolamento de cloroplastos e extração de proteínas, respectivamente e identificar o procedimento mais eficiente para cloroplastos de folhas de pinhão-manso.

MÉTODOS:

As folhas foram provenientes da casa de vegetação da UFPE, sendo armazenadas em tubo tipo Falcon de 50 ml e estocadas em nitrogênio líquido e depois armazenadas em frezzer -80 ºC até o isolamento dos cloroplastos. Foram testados quatro protocolos para o isolamento dos cloroplastos. Os protocolos testados foram: protocolo de Triboush com modificações, protocolo sorbitol com modificações, protocolo de Fan com modificações e protocolo de Dickmann com soluções do protocolo de Mariac. Em todos os protocolos foram feitas as macerações das folhas em almofariz e pistilo sob gelo, com as respectivas soluções de cada protocolo, depois filtrados em funil. Após o isolamento foram observados em microscópio óptico. Foram testados os seguintes protocolos para extração de proteínas: método fenólico com modificações, método TCA-acetona com modificações, método de Wang com modificações e o método BPP com modificações. As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford e foi verificada a integridade através de gel SDS-PAGE 12,5%, sendo corado por Coomassie Blue. A digitalização das imagens foi realizada em scanner de transparência Image Scanner III e as análises no programa Image Master 2DPlatinum v.7.05, ambos da GE Life Science.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

O protocolo de Dickmann com as soluções do protocolo de Mariac foi o que mostrou-se mais eficiente em relação aos demais pois apresentou uma maior quantidade de cloroplastos íntegros, enquanto no Triboush os cloroplastos visualizados apresentaram-se degradados, e as outras duas metodologias apresentaram uma grande quantidade de células integras e fragmentos teciduais, como traqueoides. Na extração das proteínas o método de Wang no segundo dia extração não mostrou formação de pellet, provavelmente devido á quantidade de cloroplastos serem insuficiente, o método fenólico apresentou uma concentração de proteínas de 1,300 µg/µL maior e bandas no gel SDS-PAGE mais intensas que TCA-acetona que foi de 0,900 µg/µL, mas apresentou-se inferior em concentração de proteínas e intensidade no gel em relação ao protocolo BPP que apresentou concentração de 1,700 µg/µL, evidenciando desta maneira que o método BPP foi mais eficiente.

CONCLUSÕES:

Foi constatado que o melhor protocolo para o isolamento de cloroplastos de folhas de pinhão-manso é pelo método de Dickmann com as soluções do protocolo de Mariac e o método de BPP foi o mais eficiente para extração de proteínas totais de cloroplasto, sendo necessária a continuação dos estudos do proteoma cloroplastidial de pinhão-manso para o melhoramento da cultura.

Palavras-chave: Biodiesel, Cloroplastidiais, Proteômica.