65ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

AVALIAÇÃO DA FUNCIONALIDADE DO GENE AGT1 DE LEVEDURAS INDUSTRIAIS Saccharomyces cerevisiae PRODUTORAS DE ÁLCOOL COMBUSTÍVEL

Victor Ribeiro de Godoy - Universidade Federal de Santa Catarina Gabriela Muller - Universidade Federal de Santa Catarina Boris Juan Carlos Ugarte Stambuk - Universidade Federal de Santa Catarina

INTRODUÇÃO:

Leveduras do gênero Saccharomyces são utilizadas em diversos processos industriais, dentre eles a fermentação da sacarose para a produção de etanol combustível. A utilização da sacarose ocorre pela sua hidrólise extracelular mediada pela enzima invertase codificada pelo gene SUC2. A hidrólise libera glicose e frutose no meio que são internalizadas pelos transportadores de hexoses codificados pelos genes HXT. Entretanto, a presença do transportador de membrana codificado pelo gene AGT1 possibilita o transporte direto da sacarose para o interior da célula onde a mesma é hidrolisada pela invertase intracelular, ou pelas maltases. Apesar das linhagens industriais CAT-1 e PE-2 possuírem o gene AGT1 no seu genoma, não é observada a expressão deste gene nestas linhagens.

OBJETIVO DO TRABALHO:

O presente trabalho tem como objetivo geral estudar e avaliar a funcionalidade do gene AGT1 das leveduras industriais CAT-1 e PE-2, a fim de identificar se a não-funcionalidade desse gene nessas leveduras é oriunda de alterações na sua sequência de aminoácidos, ou alterações na sua região promotora.

MÉTODOS:

Para realizar a sobre expressão das ORFs correspondentes ao gene AGT1 das linhagens CAT-1 e PE-2 foi realizada a amplificação dessas por PCR e, posteriormente, foram clonadas em um plasmídeo de clonagem (PCR TOPO). A seguir, o gene foi digerido do plasmídeo com a enzima BamHI e subclonado no vetor de leveduras pGRSd, contendo um promotor forte (PGPD) e terminador de transcrição (TPGK), o que permite a sobre-expressão do gene. Os novos vetores foram chamados de pGRSd-AGT1C (gene da CAT-1) e pGRSd-AGT1P (gene da PE-2), e utilizados para transformar a levedura LCM003, que tem o gene AGT1 deletado do seu genoma. A seleção dos clones transformantes foi realizada em meio contento maltotriose e antimicina A. Para dosar a atividade da permease Agt1p foi utilizado o pNF&alphaG como substrato. Também, foi realizado cinética de crescimento das cepas transformantes em meio rico contendo 20 g/L de maltotriose. O sequenciamento da região promotora das cepas CAT-1 e PE-2 foi realizado utilizando-se os primers E51G-L55H-R, AGT1promR e AGT1promF e, após, foram realizadas análises de BLASTN e alinhamento das cepas em questão com a S288C, A15, A60 e RM11-1a, cujas regiões promotoras do gene AGT1 já foram sequenciadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO:

A funcionalidade da permease Agt1p após sobre expressão do gene AGT1 foi confirmada ao observarmos, nas cepas transformantes, a presença de transporte de pNF&alphaG e, também, a capacidade de consumir e fermentar maltotriose, visto que em Saccharomyces cerevisiae esse açúcar só é transportado pela permease Agt1p. Com o sequenciamento da região promotora das cepas Cat-1 e PE-2 pudemos ver, através de alinhamento, que ambas as cepas possuíam apenas dois sítios de ligação para a proteína Malx3 (reguladora da expressão desse gene), sendo que este valor é igual ao encontrado na cepa A15, que não possui a permease Agt1p funcional. Já a cepa A60 possui três sítios de ligação para Malx3p e apresenta uma permease Agt1p funcional. Isso nos mostrou que a ausência de uma permease Agt1p funcional nas cepas CAT-1 e PE-2 pode estar associada à ausência de um sítio de ligação para Malx3p.

CONCLUSÕES:

Nossos resultados indicam que a não-funcionalidade da permease AGT1 nas linhagens industriais brasileiras CAT-1 e PE-2, utilizadas na produção de álcool combustível, não é decorrente de alterações na sequência de aminoácidos do gene AGT1, já que após a clonagem dos respectivos genes e sobre-expressão numa linhagem agt1Δ, a mesma passou a crescer, consumir e fermentar eficientemente maltotriose. A nossa analise da região promotora das cepas industriais estudadas revelou que provavelmente seja a falta de indução do gene AGT1 o responsável pela não-funcionalidade desta permease. Este resultado fornece informações que podem ser uteis para a produção/modificação de leveduras industriais brasileiras com um melhor perfil fermentativo para sacarose (através do transporte ativo deste açúcar), assim como para a fermentação de mostos ricos em maltotriose obtidos da hidrólise de amido, incluindo a produção de cerveja e uísque, e panificação.

Palavras-chave: Transporte de sacarose, Fermentação alcoólica, Clonagem.