64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 3. Enzimologia

ESTUDOS DA REGULAÇÃO DA N-ACETIL-β-D-GLICOSAMINIDASE PRODUZIDAS POR Trichoderma harzianum APÓS CRESCIMENTO EM DIFERENTES FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO

Ana Carolina Rezende 1 Cirano José Ulhoa 2

1. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – UFG 2. Prof. Dr./ Orientador- Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – UFG

INTRODUÇÃO:

O gênero Trichoderma compreende um grupo de fungos filamentosos encontrados no solo e em raízes de várias espécies de plantas. São antagonistas a outros fungos, sendo utilizados como agentes de biocontrole dos fitopatógenos de interesse na agricultura. Fungos do gênero Trichoderma, principalmente T.harzianum, são conhecidos como bons produtores das enzimas 1,3/1,6 glucanases, quitinases e N-acetilglicosaminidase. Desde 1996 que o grupo do laboratório de enzimologia (ICB/ UFG) tem concentrado esforços no sentido de contribuir para o entendimento de micoparasitismo e controle biológico. Considerando a importância das enzimas do sistema quitinolítico no mecanismo de Micoparasitismo e o potencial de utilização de fungo do gênero Trichoderma em controle biológico, estamos propondo neste projeto fazer uma avaliação da produção da enzima N-acetilglicosaminidase por Trichoderma harzinaum ALL 42 em diferentes fontes de carbono.

METODOLOGIA:

Os isolados de Tricoderma harzianum, da coleção do laboratório de Enzimologia/UFG, foram mantidos em repiques periódicos em meio MYG e estocados a 4°C. Para a produção de N-acetilglicosaminidase, 107 esporos dos isolados foram inoculados no meio TLE suplementados com 0,5% de fontes carbono (as fontes de nitrogênio foram retiradas do meio). As fontes de carbono usadas foram: Lactose, sacarose, glicose e N-acetilglicosamina. Sendo que para cada frasco contendo o meio e os esporos, foi suplementada uma fonte de carbono diferente. Em seguidaos frascos foram incubados em shakers a 28°C por 48 horas a rotação de 140 rpm. A concentração de proteína nas amostras foi determinada pelo método de Bradford (1976). A atividade de N-acetilglicosaminidase foi determinada nas condições de reação feitas de acordo com Yabuki et al., (1986). A capacidade de redução dos açúcares foi determinada usando o método de detecção de açúcares redutores. A análise do perfil de proteínas secretadas, o grau de pureza e o peso molecular foram determinados utilizando-se o sistema de eletroforese em gel de poliacrilamida (12% p/v) em condições desnaturantes, conforme descrito por LAEMMLI (1970).Todos os procedimentos foram realizados no laboratório de Enzimologia do Instituto de Ciências Biológicas/UFG.

RESULTADOS:

Utilizando como substrato pNPNAG, a enzima apresentou uma maior atividade quando o N-acetilglicosamina foi usado como fonte de carbono no meio de cultura. Esta atividade foi significativamente relevante, quando comparadas com as atividades da NAGase produzida nos meios de cultura que foram usadas as demais fontes de carbono. Sendo esta fonte então a melhor indutora de N-acetilglicosaminidase. Foi medido o pH das soluções contendo a NAGase induzida nas diferentes fontes de carbono. As fontes de carbono alteraram o pH das soluções, sendo que o pH básico gerado pela N-acetilglicosamina, foi favorável para uma maior liberação de N-acetilglicosaminidase no meio de cultura. A utilização do método ADNS possibilitou avaliar os teores de glicose, lactose, sacarose e N-acetilglicosamina existentes nas suas respectivas soluções (sobrenadante contendo a enzima). observou-se que a lactose não foi consumida pelo fungo como fonte de nutriente. A N-acetilglicosamina foi consumida parcialmente e os açúcares glicose e sacarose foram praticamente consumidos por completo pelo fungo. A análise do gel mostrou que o perfil protéico foi maior quando foi usado N-acetilglicosamina como fonte de carbono no meio. Mostrando que o fungo produziu maior quantidade de proteínas com esta fonte de carbono.

CONCLUSÃO:

Os resultados obtidos mostraram que a produção desta enzima depende da fonte de carbono. Foi mostrado, através das metodologias utilizadas para esta avaliação enzimática de NAGase, que o melhor indutor a ser usado como fonte de carbono no meio de cultura é a N-acetilglicosamina. Já que o fungo secreta uma quantidade maior de proteínas, incluindo especificamente a NAGase, quando esta fonte de carbono é usada. Observou-se também que o pH dos sobrenadantes utilizados como fonte de enzima apresentaram diferenças, sendo alcalino (pH 7,4) o sobrenadante que apresentou melhor atividade enzimática (tendo N-acetilglicosamina com fonte de carbono).

Palavras-chave: Trichoderma harzianum, enzimas hidrolíticas, N-acetilglicosaminida.