64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 6. Bioquímica

Avaliação do Perfil de Modificação Protéica por Fosfotreonina e Fosfotirosina por SDS-PAGE/Western blotting em um Modelo Murino de Progressão do Melanoma

Nívea Maria Rocha Macedo 1 Lara Zimmermann 2 Roger Chammas 2 José César Rosa 3

1. SETOR DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR, INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE - UFAL 2. LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL, FACULDADE DE MEDICINA – USP 3. CENTRO DE QUÍMICA DE PROTEÍNAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGÊNICOS, FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO - USP

INTRODUÇÃO:

A modificação pós-traducional (MPT) mais estudada é a fosforilação de proteínas, a qual foi descrita pela primeira vez por Edwin Krebs e Edmond Fisher em 1955. Acredita-se que cerca de 75% de todas as proteínas celulares são fosforiladas, frequentemente em múltiplos sítios, e cada evento de fosforilação deve ter um efeito distinto na função protéica. A fosforilação de proteínas é um mecanismo que controla a transdução de sinais e atividade protéica e pode modular processos celulares fundamentais, incluindo diferenciação celular, metabolismo, expressão gênica, motilidade, divisão e sobrevivência. Essa MPT desempenha um dos principais papéis nas vias de sinalização de todas as células eucarióticas. A disrupção nos eventos de sinalização celular mediados por fosforilação está associada a várias doenças, incluindo o câncer. Portanto, entende-se que proteínas que sofrem alterações nos níveis de fosforilação durante a progressão tumoral são potenciais marcadores desse processo. Assim, o presente trabalho realizou a análise de fosforilação protéica em resíduos de treonina e tirosina em 3 linhagens celulares, uma derivada de melanócitos (Melan-A) e duas linhagens de melanoma derivadas de Melan A, denominadas TM1 e TM5.

METODOLOGIA:

Para verificar o nível global de proteínas modificadas por fosforilação em resíduos de treonina e tirosina, foram realizados ensaios em duplicata, nos quais alíquotas de 5 µg de cada extrato protéico foram imobilizadas em membranas de nitrocelulose. Os anticorpos primários monoclonais anti-fosfotreonina e anti-fosfotirosina foram utilizados nas diluições 1:75 e 1:750, respectivamente. Os anticorpos secundários foram utilizados na diluição 1:4000. Os ensaios foram revelados pelo método de colorimetria. Para análise dessas proteínas por Western blotting, foi realizada a separação de 20 µg dos extratos protéicos de Melan-A, TM1 e TM5 por SDS PAGE, eletrotransferência para membrana de nitrocelulose e sondagem com os anticorpos anti-fosfotreonina e anti-fosfotirosina nas mesmas diluições descritas para o ensaio de dot blotting. As bandas protéicas que, no ensaio de Western blotting, apresentaram níveis de marcação alterados para as modificações pós-traducionais analisadas quando comparada a linhagem Melan-A com as linhagens TM1 e TM5, foram excisadas do gel SDS-PAGE, submetidas à digestão tripsínica e analisadas por espectrometria de massas. As proteínas identificadas foram submetidas à análise pelo NetPhos 2.0 quanto à presença de possíveis sítios para fosfotreonina e fosfotirosina.

RESULTADOS:

Na análise densitométrica dos dot blottings foi possível observar um aumento na fosforilação em resíduos de tirosina em TM1 e TM5 em relação à Melan-A, no entanto, não foi possível distinguir alterações marcantes nos níveis de proteínas modificadas por fosfotreonina nas linhagens estudadas. Por meio do ensaio de Western blotting foi possível observar que somente a banda 7 apresentou alteração na marcação para fosfotreonina nas linhagens estudadas, estando essa marcação aumentada nas células tumorais. Foram identificadas 3 proteínas nessa banda e, de acordo com o NetPhos, essas proteínas possuem resíduos de treonina que são alvos potenciais de fosforilação. No entanto, somente a proteína heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 está citada na literatura como fosforilada em resíduos de treonina. O Western blotting revelou 19 bandas contendo proteínas modificadas por fosfotirosina, entretanto, somente as bandas 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17 apresentaram marcação aumentada nas linhagens tumorais. Foram identificadas 25 proteínas nessas bandas e, de acordo com o NetPhos, todas essas proteínas possuem resíduos de treonina que são alvos potenciais de fosforilação. No entanto, somente 13 proteínas estão citadas na literatura como fosforiladas em resíduos de tirosina.

CONCLUSÃO:

O presente trabalho sugere a ocorrência do aumento nos níveis de fosforilação em resíduos de treonina e tirosina durante a progressão desse modelo murino de progressão do melanoma. As proteínas identificadas nas bandas protéicas com níveis aumentados de marcação para taís MPTs apresentam, segundo o software NetPhos 2.0, resíduos de treonina e tirosina que são potenciais alvos de fosforilação. Algumas das proteínas identificadas têm sido citadas com fosforiladas em resíduos de treonina ou tirosina.

Palavras-chave: Melanoma, Proteômica, Fosforilação de proteínas.