63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

DESENVOLVIMENTO DE PARES DE PRIMERS MICROSSATÉLITES PARA MARACUJAZEIRO 'DO-MATO' (Passiflora Cincinnata Mast.) A PARTIR DE BIBLIOTECA GENÔMICA ENRIQUECIDA

Mel Reis Loureiro 1 Carlos Bernard M. Cerqueira-Silva 2 Elisa S. Lisboa dos Santos 3 Gustavo Maruyama Mori 4 Ronan Xavier Correa 5 Anete Pereira de Souza 4

1. Depto. Estudos Básicos e Instrumentais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB, Itapetinga-BA 2. Prof. Msc./ Orientador - Depto. Estudos Básicos e Instrumentais, UESB, Itapetinga-BA 3. Profa. Depto. Estudos Básicos e Instrumentais, UESB, Itapetinga-BA 4. Depto. Biologia Vegetal, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas-SP 5. Prof. Depto. Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC, Ilhéus-BA

INTRODUÇÃO:

A espécie P. cincinnata Mast. é uma representante silvestre do gênero Passiflora, seu fruto é popularmente conhecido como maracujá ‘do-mato’ e é encontrada no Brasil, do Pará até o Mato Grosso do Sul (Bernacci, 2003). Estudos genéticos e fitopatológicos permitem considerar a espécie como importante na produção de porta-enxertos para P. edulis e P. alata, uma vez que é tolerante à seca (Araújo et al., 2004), a doenças causadas por bactérias (São José, 1994; Meletti et al., 2002) e a nematóides, podendo ser utilizada em programas de melhoramento genético. Dentre as estratégias utilizadas para estudos de caracterização genética, tem-se o uso de diferentes marcadores moleculares. Dentre estes marcadores os microssatélites (SSR) apresentam padrão de segregação co-dominante e permitem a máxima avaliação da informação genética. Contudo, para a grande maioria das passifloras, a exemplo do maracujazeiro ‘do-mato’, inexistem estudos envolvendo os SSR. Neste contexto, objetivou-se desenvolver e caracterizar uma biblioteca genômica enriquecida em regiões microssatélites para o maracujazeiro ‘do-mato’.

METODOLOGIA:

Foi realizada extração de DNA a partir de amostras foliares jovens, adotando-se o método CTAB. O desenvolvimento da biblioteca enriquecida seguiu o protocolo proposto por Billotte et al. (1999), sendo realizada digestão de DNA com enzimas de corte frequente RSAI. Os clones com SSR foram selecionados após a digestão, por meio da hibridização desses fragmentos com oligonucleotídeos biotinilados, recuperados por partículas magnéticas ligadas à streptavidina. A partir dos fragmentos recuperados foi construída a biblioteca. Colônias recombinantes foram identificadas empregando-se o reativo biomolecular x-gal. O DNA plasmidial foi extraído dos clones positivos e os insertos, sequenciados. As sequências obtidas foram editadas e triadas com os programa SeqMan (pacote DNA Star) e Microsat, respectivamente. As mesmas tiveram seu enriquecimento avaliado com o programa SSRIT Tool, disponível em www.gramene.org. Os primers foram obtidos com o auxílio dos programas Primer 3 Plus (http://www.bioinformatics.nl/) e Primer Select (pacote DNA Star), adotando-se os critérios: tamanho do produto amplificado entre 100 e 300 pb; tamanho dos primers entre 18 e 22 pb; temperatura média de anelamento entre 40ºC e 65ºC (diferença máxima de 3ºC entre os pares de primers), concentração de GC entre 35% e 70%.

RESULTADOS:

Para a biblioteca utilizada, foram desenvolvidas duas placas, a primeira com um enriquecimento de 38,5% e a segunda com 26%. No total, 62 sequências continham regiões para desenho de primers SSR. Foram desenvolvidos 15 pares de primers que flanqueiam regiões com motivo de dinucleotídeo, dez com trinucleotídeo, sete com tetranucleotídeo e um composto de di e trinucleotídeo, totalizando 33 pares de primers. As regiões SSR observadas apresentaram motivos com número de repetições variando entre quatro e 21 (para motivos de Di e Trinucleotídeos) e entre três e seis (para os motivos de tetranucleotídes). A temperatura de anelamento variou entre 56 e 60ºC. As demais 29 sequências foram inviáveis para o desenho de primers, por possuírem tamanho insuficiente ou pelo fato das regiões SSR estarem no fim das sequências. Trabalhos como os de Cerqueira-Silva et al. (2010) e Viana et al. (2003) com o RAPD, Segura et al. (2002) com o AFLP e os de Oliveira et al. (2005) e Pádua et al., (2005) com SSR, são exemplos de marcadores moleculares aplicados em Passiflora. Porém, os resultados do presente estudo compõem a primeira biblioteca genômica enriquecida em regiões SSR para P. cincinnata e poderão ser utilizados em mapeamentos e ou programas de melhoramento genético que envolva esta espécie.

CONCLUSÃO:

Os 33 pares de primers obtidos apresentam características desejáveis para a genotipagem de indivíduos em géis de poliacrilamida 6%, o que viabilizará posteriores estudos de diversidade e/ou melhoramento genético.

Palavras-chave: Passiflora cincinnata Mast., Marcadores moleculares, Diversidade.