63ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 5. Genética Vegetal

AVALIAÇÃO DAS ISOENZIMAS MALATO DESIDROGENASE E FOSFATASE ÁCIDA DE Conyza bonariensis E Conyza canadensis

Denis Bassi 1 Maycon Rodrigo Ruiz Bevilaqua 2 Claudete Aparecida Mangolin 3 Maria de Fátima Pires da Silva Machado 4 Rubem Siverio de Oliveira Junior 5 Sandra Aparecida de Oliveira Collet 6

1. Graduando de Agronomia - UEM 2. Pós-graduando em Biologia Comparada - UEM 3. Profa. Dra. - Depto de Biologia Celular e Genética - UEM 4. Profa. Dra. - Depto de Biologia Celular e Genética - UEM 5. Prof. Dr. - Depto de Agronomia - UEM 6. Profa. Dra./Orientadora - Depto de Biologia Celular e Genética - UEM

INTRODUÇÃO:

Nos últimos anos a buva vem causando prejuízos nas lavouras do Brasil. Além disso, o surgimento de indivíduos resistentes ao Glifosato torna o controle ainda mais difícil. Há várias hipóteses que discutem o mecanismo de resistência. Algumas afirmam que a translocação do herbicida pelos diferentes tecidos da planta, nos biótipos resistentes de Conyza bonariensis, encontrou-se comprometida. A variabilidade genética é uma das principais características das plantas daninhas, que permite a adaptação e a sobrevivência dessas espécies em condições ambientais adversas, portanto é considerada como fonte inicial de resistência em uma população suscetível de plantas invasoras. O estudo isoenzimático das plantas daninhas é interessante, pois há hipóteses de que certas isoenzimas contribuem para a diminuição da fitotoxicidez causada pelos princípios ativos, presentes no mercado. A identificação correta das espécies C. canadensis e C. bonariensis é importante para que se possa escolher apropriadamente a melhor estratégia de controle e identificar o mecanismo de resistência que está envolvido em cada espécie, pois até o atual momento ele ainda é desconhecido. Portanto o objetivo deste trabalho foi padronizar as condições eletroforéticas adequadas para as isoenzimas malato desidrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) e fosfatase ácida (ACP; EC 3.1.3.2), de C. canadensis e C. bonariensis.

METODOLOGIA:

Pequenos brotos e folhas jovens das duas espécies de Conyza foram colocados em tubos de 1,5mL, mantidos no gelo e homogeneizados com uma solução de extração. Quatro soluções de extração foram testadas, estas consistiam basicamente de solução tampão, antioxidantes e complexadores de fenóis. Em seguida as amostras foram centrifugadas em centrífuga refrigerada durante 30 minutos com 12.000 r.p.m. e 40C. Os sobrenadantes foram adsorvidos em papel de filtro (4x5mm) e aplicados em gel de amido 16% (Penetrose 50 ®). Para o preparo do gel, duas soluções tampão foram testadas, tampão Tris (0,0103M) e ácido cítrico (0,0028M) pH:7,0 e a outra, tampão Tris 0,1M; pH:8,8. Duas soluções tampão foram testadas para os eletrodos: Tampão 1: Tris (0,155M) e ácido cítrico (0,043M),pH: 7,0. Tampão 2: hidróxido de sódio 0,05M ácido bórico 0,3M, pH 8,0. A migração foi realizada com 50 V nas extremidades. Foram testados dois tempos de duração da eletroforese: 15 e 13 horas. Para a coloração da isoenzima malato desidrogenase foram testadas três quantidades de ácido málico, 150, 300 e 600 mg, dissolvido em 15 mL de tampão tris-HCl 0,1M , com o pH ajustado para 8,6, a esta solução foi adicionado 6 mg de NAD+, 0,5ml de MTT(5mg/ml), 0,8ml de PMS (5mg/ml) e 15ml de Agar 2%. Para a coloração da ACP, foram utilizados 50 mL de tampão acetato de sódio 0,1M pH 5.0, 1,5 mL de naftil fosfato 1% e 25 mg do corante Fast Blue RR Salt.

RESULTADOS:

As soluções de extração testadas não diferiram na resolução e intensidade das bandas das isoenzimas MDH e ACP. A solução de extração escolhida foi preparada com: 0,05g PVP-40, 10µl EDTA 1mM, 5µl Β-mercaptoetanol e Tampão Fosfato 1M; pH 7,0, q.s.p 1mL. O tampão Tris 0,0103M e ácido cítrico 0,0028M, pH 7,0, foi o mais adequado para o preparo do gel e para os eletrodos foi Tris 0,155M e ácido cítrico 0,043M, pH 7,0. Este sistema também apresentou resultados satisfatórios para a isoenzima MDH extraída de Cereus peruvianus. Em relação ao tempo de duração da eletroforese, 13 horas foi melhor para separação das bandas. Para a coloração da MDH, a quantidade de 600 mg do substrato ácido málico, foi a mais adequada deixando as bandas mais nítidas. No gel de MDH de Conyza, foi possível observar 12 isoenzimas MDH, de diferentes regiões celulares: do citosol (MDHc), da mitocôndria (MDHmt) e de microcorpos (MDHmb). As 3 regiões parecem apresentar polimorfismos para MDH. A identificação destas 3 formas foi pela comparação com géis de MDH de outras espécies. A isoenzima malato desidrogenase tem sido considerada um ótimo marcador bioquímico por apresentar um alto grau de variação em sua expressão, dentro e entre, as mais variadas espécies. Foi possível observar 2 loci da isoenzima ACP, ACP-1 com 4 alelos e ACP-2 com 3 alelos, ambos com polimorfismos entre as plantas de Conyza.

CONCLUSÃO:

Os testes de padronização permitiram evidenciar em géis de amido várias formas das isoenzimas MDH e ACP. Estas isoenzimas poderão ser usadas como marcadores de resistência, de diferenciação entre as espécies e também para estudo de variabilidade genética do gênero Conyza.

Palavras-chave: Conyza sp, Planta daninha, Planta daninha.