62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 4. Genética Molecular

ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA PELO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2) EM CÉLULAS HUMANAS PROFICIENTES E DEFICIENTES NO REPARO DE DNA

Juliana Alves Brandão 1 Julliane Tamara Araújo de Melo 1 Acarízia Eduardo da Silva 1 Tirzah Braz Petta Lajus 2 Lucymara Fassarela Agnez-Lima 1

1. Depto.Genética, Laboratório de Biologia Molecular e Genômica - LBMG - UFRN 2. Liga Norte Riograndense contra o Câncer - LNRCC, Natal-RN

INTRODUÇÃO:

O genoma dos seres vivos está continuamente sofrendo ações de diversos agentes endógenos que podem causar danos no DNA, os quais são provenientes de oxidações e hidrólises que ocorrem constantemente em nosso organismo, levando à formação de espécies reativas de oxigênio (EROS). O peróxido de hidrogênio (H2O2) é uma das principais espécies reativas e está envolvido em importantes funções celulares. Porém, em situações de estresse oxidativo, o H2O2 pode oxidar biomoléculas como o DNA. Uma vez que o DNA contém a informação genética das células, esta molécula não deve ter suas lesões removidas por degradação. A remoção dos danos oxidativos é realizada principalmente pela via de reparo por excisão de bases (BER), e a proteína APE1/Ref-1 tem se mostrado importante na regulação de respostas celulares ao estresse oxidativo. Além disso, têm sido descrito a participação do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na remoção de danos oxidativos e na estimulação da função de reparo da APE1/Ref-1 por proteínas da via NER. Contudo ainda não foi evidenciada a expressão dessa proteína em células humanas deficientes na via NER. Desta forma, o objetivo deste estudo é avaliar a sobrevivência de células proficientes e deficientes na via NER após o tratamento com H2O2 e, em paralelo, estudar a expressão de APE1/Ref-1 nestas células.

METODOLOGIA:

Para realização dos experimentos foram utilizadas linhagens celulares proficientes e deficientes na via NER gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck (ICB-USP, São Paulo, SP): MRC5-SV (Proficiente na via NER), XP12RO (XPA), XP4PA (XPC) e CS1AN (CSB) (Deficientes na via NER). Para o ensaio de viabilidade celular, as células foram tratadas com diferentes concentrações de H2O2, que variaram entre 0,5mM até 2mM e incubadas por 20 minutos à 37ºC e 5%CO2 . Passado o tratamento, as células são incubadas por 48 horas em meio DMEM completo e realizada a contagem de células em Câmara de Neubauer, pelo método de exclusão por Azul de Trypan. Para extração de proteínas totais, nosso laboratório baseou-se na metodologia utilizada por Petta et al. (2008). As células foram tratadas com H2O2 0,5mM por 20 minutos e as proteínas totais foram extraídas nos tempos 5, 10, 15, 30 e 60 minutos após o tratamento. As proteínas totais extraídas foram quantificadas utilizando-se o método de Bradford. Uma alíquota do extrato de proteínas totais foi separada eletroforicamente em gel SDS-PAGE 10% durante 3 horas e posteriormente utilizado para Immunoblotting. Para detecção das bandas, a membrana foi revelada pelo método de quimioluminescência e a quantificação das bandas realizada no programa ImageJ.

RESULTADOS:

O ensaio de viabilidade celular realizado em nosso laboratório demonstrou que, após tratamento com peróxido de hidrogênio, as linhagens celulares XPA e CSB se mostraram mais sensíveis quando comparadas com as linhagens XPC e MRC5. A sensibilidade ao H2O2 só se mostra estatisticamente significativa quando se compara as linhagens XPA e CSB com as linhagens XPC e MRC5. Já a análise da expressão de APE1/Ref-1 no extrato de proteínas totais das linhagens tratadas revelou que o tratamento das células com peróxido de hidrogênio não se mostrou capaz de alterar significativamente a expressão da proteína nos tempos observados. Diversos estudos têm evidenciado a participação das proteínas XPA e CSB no reparo de danos oxidativos, o que poderia justificar a maior sensibilidade de linhagens deficientes nessas proteínas quando expostas ao peróxido de hidrogênio. Já o fato da linhagem XPC não ter apresentado uma resposta significativamente diferente na sobrevivência celular quando comparado com a linhagem selvagem, indica que a ausência da proteína XPC pode não estar afetando diretamente o reparo de danos oxidativos. Ou seja, apesar destas três proteínas estarem atuando na mesma via NER para reparar lesões que destorcem a dupla-hélice do DNA, em condições fisiológicas de estresse oxidativo, estas proteínas podem estar atuando em vias distintas.

CONCLUSÃO:

Linhagens deficientes na via de reparo por excisão de nucleotídeos se apresentam mais sensíveis ao tratamento com agentes responsáveis por causar danos oxidativos, como no caso do peróxido de hidrogênio. Estes resultados sugerem que as vias de reparo de DNA podem atuar em sinergia para corrigir diferentes tipos de lesões e desta forma existe uma dinâmica celular que deve ser levada em consideração. Nossos resultados também mostram que em doses nas quais a sobrevivência celular é considerável, não é possível observar a alteração significativa na expressão da proteína APE1/Ref-1. Esta ausência de alteração dos níveis protéicos não indica que esta proteína seja menos importante no reparo de lesões oxidativas nestas linhagens, mas apenas que a sua dinâmica não é alterada considerando uma detecção pelo método de western blotting de proteínas totais.

Instituição de Fomento: CNPq, FAPERN e Rede Redoxoma - Processo Redox em Biomedicina

Palavras-chave: Estresse Oxidativo, Peróxido de Hidrogênio, APE1/Ref-1.