62ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 2. Genética de Microorganismos

ACOMPANHAMENTO DA DINÂMICA DE LEVEDURAS NA DESTILARIA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA UTILIZANDO O MARCADOR (GTG)5

Mariana de Lucena Soares 1 Adauto Gomes Barbosa Neto 1 Paula Katharina Nogueira da Silva 1 Rafael Barros de Souza 2 João Assis Scavuzzi Menezes 2 Bereneuza Tavares Ramos Valente Brasileiro 1, 2

1. Centro de C. Biológicas e Saúde, Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP 2. Genetech Bioprodutividade

INTRODUÇÃO:

O Brasil após anos de utilização do etanol como combustível, hoje, ele começa a ser admirado positivamente pelo mundo todo, visto que a nossa opção de combustível, comparado a gasolina, é uma das nossas alternativas de combustível limpo e que tem na origem renovável seu maior diferencial ambiental. Conhecido também como bioetanol, a obtenção deste produto, através do processo de fermentação de caldo de cana e melaço por microrganismo, confere ao combustível uma produção sustentável (GUEIROS, 2006). A produção industrial de álcool combustível é um processo aberto que se baseia na fermentação dos açúcares do caldo da cana e/ou melaço por células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Este processo envolve o reciclo das leveduras, e com isso pode ocorrer o reciclo de contaminantes causando diversos distúrbios tais como: consumo de açúcar e etanol pelas contaminantes, queda da viabilidade e morte das células das leveduras nativas devido a toxinas lançadas no meio pela contaminante (ALTHERTUM, 1984). Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a dinâmica populacional da microbiota leveduriforme da Usina Trapiche - PE, durante um período de quatro meses da safra 2009/2010, tendo grande relevância o acompanhamento de leveduras selvagens na produção.

METODOLOGIA:

Foram realizadas quatro coletas do mosto fermentado, num período de 118 dias, retiradas diretamente da dorna de fermentação, e transportada em recipiente adequado e refrigerado, ao laboratório da empresa Genetech, Recife/PE. Em laboratório, após homogeneização, foi retirado 1 mL da amostra e adicionado a 9 mL de água destilada autoclavada, seguida de diluições seriadas até 10-7. Posteriormente, foi retirada uma alíquota que foi semeada, em triplicata, em placa de Petri contendo meio WLN com antibiótico e incubada por 5 dias a 33ºC. Após incubação, as colônias foram classificadas e quantificadas quanto ao bordo, ao tamanho, à superfície e à coloração, que observadas às proporções de expressão em placa, foram selecionadas. Estas leveduras foram submetidas à análise molecular baseada em PCR-Fingerprint através do iniciador (GTG)5, que permite a amplificação das regiões de inter-seqüências simples repetidas (ISSR). Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose, que após revelação dos perfis eletroforéticos foram identificados de acordo com o banco de dados das espécies de leveduras da Micoteca Genetech onde o perfil de cada isolado é caracterizado por um padrão de fragmentos, representando sua identidade genética.

RESULTADOS:

Através das análises da tipagem molecular foi possível verificar o dinamismo da microbiota envolvida no processo de fermentação alcoólica. Na coleta 0 (C00), início da fermentação, foi observado à presença dos perfis P1, P1A, P4 e P6, de S. cerevisiae, com percentual de expressão de 20%, 10%, 60% e 10%, respectivamente. Diferente da C01 (20 dias de safra), que teve somente leveduras contaminantes da espécie Dekkera bruxellensis. Na coleta C02 (85 dias de safra), os perfis de S. cerevisiae P15A (20%) e P18 (80%). Já na C03 (118 dias de safra), os perfis P32 (70%) e P32A (30%) e na C04 (135 dias de safra), P32 (90%) e P32A (10%). A partir destes dados, o percentual de expressão dos perfis de S. cerevisae totalizou 75% de dominância e de D. bruxellensis com 25%. No começo da fermentação, o perfil P4 de S. cerevisae predominou, pois foi o inóculo de partida utilizado pela destilaria. Os outros perfis apareceram por já está no processo através do caldo de alimentação que é posto nas dornas para ser fermentado. No decorrer da safra, apareceu um surto de contaminação com 100% de D. bruxellensis, onde a causa ainda é desconhecida. E nas demais coletas já se pode evidenciar outros perfis diferentes, com o aparecimento de dois novos ao final da safra, P32 e P32A.

CONCLUSÃO:

A partir dos resultados obtidos, é possível concluir que nas cinco coletas analisadas houve um grande dinamismo da população de leveduras presente no processo de fermentação industrial na Usina Trapiche - PE. A caracterização dos perfis genéticos indicou diferentes linhagens de S. cerevisiae com frequências variáveis nos 118 dias de safra, não predominando nenhum perfil nas cinco coletas. A amplificação da região ISSR permitiu a descriminação de espécies de leveduras contaminantes diferentes de S. cerevisiae, constatando-se assim a eficiência do marcador (GTG)5 como uma ferramenta de identificação rápida para o controle microbiológico do processo.

Instituição de Fomento: GENETECH BIOPRODUTIVIDADE

Palavras-chave: Acompanhamento microbiológico, Saccharomyces cerevisiae, Caracterização molecular.