62ª Reunião Anual da SBPC
C. Ciências Biológicas - 8. Genética - 2. Genética de Microorganismos
IDENTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE tcpA EM CEPAS DE Vibrio cholerae O26 ISOLADAS DE PROCESSOS ENTÉRICOS HUMANOS NO BRASIL
Mariana de Lira Nunes 2, 1
Ana Paula Rocha da Costa 2, 1
Nilma Cintra Leal 2
1. Universidade Federal de Pernambuco/UFPE
2. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/UFPE
INTRODUÇÃO:

A cólera é uma doença infecciosa intestinal aguda causada pelo Vibrio cholerae. Cepas epidêmicas de V. cholerae possuem dois elementos genéticos distintos diretamente envolvidos em sua virulência: o profago CTXphi, onde se encontram os genes codificadores da toxina colérica, e a ilha de patogenicidade de Vibrio (VPI), onde se localiza o gene tcpA, codificador do pilus corregulador de toxina (TCP). O TCP além de permitir a colonização do epitélio intestinal pelo V. cholerae, é o receptor para a entrada do profago CTXphi em novas células. Análises moleculares realizadas em cepas de V. cholerae não-O1/não-O139 isoladas entre 1992 e 2000, revelaram a presença de genes do profago CTXphiem 14 cepas de V. cholerae O26 e em uma não tipável, no entanto, apenas em duas dessas cepas foi detectado o gene tcpA El Tor. Uma vez que o produto desse gene é o receptor do profago CTXphi, a ausência na detecção do gene tcpA apontou para a presença de um alelo variante nas cepas em questão. Corroborando essa hipótese, ao se utilizar primers externos ao gene tcpA obteve-se fragmento de tamanho esperado em todas as cepas de V. cholerae O26 e na cepa não tipável. Este trabalho teve como objetivo analisar a expressão da proteína TcpA nas cepas de V. cholerae que apresentam o gene variante.

METODOLOGIA:
Para o desenvolvimento desse trabalho, uma cepa de V. cholerae O1 biotipo El Tor, isolada em São Bento do Una em Pernambuco, teve seu DNA extraído e, posteriormente, utilizado para amplificação do gene tcpA por PCR. O produto de amplificação obtido foi clonado no vetor pET-21a. As construções plasmidiais tcpA/pET-21a foram utilizadas na transformação de células competentes de Escherichia coli da linhagem DH, sendo seu DNA extraído pelo método de minipreparação. Alguns clones foram sequenciados, para avaliar o padrão de qualidade de suas sequências, sendo utilizados para transformar células competentes de E. coli da linhagem BL21 para expressão da proteína recombinante TcpA. A proteína foi utilizada na imunização de coelhos para obtenção de soro policlonal. Em paralelo, foram produzidos extratos protéicos das cepas de V. cholerae O26 e da cepa não tipável, assim como de duas cepas de V. cholerae O1, sendo uma do biótipo Clássico e outra El Tor, além de uma cepa de Aeromonas veronii. O soro policlonal obtido foi utilizado em ensaios de Western Blot para detecção da proteína TcpA nos extratos bacterianos.
RESULTADOS:
Análises moleculares preliminares realizadas pelo nosso grupo de pesquisa nas cepas de V. cholerae O26 e na cepa não tipável, revelaram que as cepas que não tiveram o gene tcpA amplificado ao se utilizar o primer para o alelo El Tor, apresentam um variante do gene denominado tcpA-env, presente em cepas ambientais de V. cholerae não O1/não O139. Nos ensaios de Western Blot realizados observou-se a expressão da proteína TcpA em todas as cepas analisadas, com exceção da cepa de A. veronii. Esse resultado demonstra que o soro policlonal é específico para detecção da proteína TcpA, pois não detectou a mesma no extrato de A. veronii, bactéria filogeneticamente próxima ao V. cholerae, relacionada a distúrbios gastrointestinais, utilizada nesse estudo como controle negativo. O soro policlonal foi capaz de detectar a presença da proteína TcpA nas cepas de V. cholerae O1 biotipo El Tor e Clássico, portadoras de diferentes alelos do gene tcpA, alelo El Tor e alelo clássico, respectivamente, utilizadas como controle positivo nesse estudo. Nas cepas de V. cholerae O26, portadoras do alelo ambiental, também foi detectada a presença da proteína TcpA, revelando que a homologia protéica se mantém em níveis bastante representativos.
CONCLUSÃO:
Apesar de ser considerada como alvo de pesquisa há vários anos, a cólera continua atingindo cinco milhões de pessoas todos os anos, sendo reportada como um grande problema de saúde pública em diversas áreas do mundo. Atualmente, apenas os sorogrupos O1 e O139 são reconhecidos como causadores de epidemias coléricas. Sendo assim, o diagnóstico tradicional da cólera no Brasil utiliza como critério de triagem apenas a reação de soroaglutinação das cepas isoladas, negligenciando cepas de V. cholerae não-O1/ não-O139 que podem possuir todo o conjunto de genes de virulência presentes nos sorogrupos epidêmicos de V. cholerae. Corroborando essa hipótese, os resultados obtidos nesse estudo apontam para a patogenicidade, e possível potencial epidêmico, de cepas que não pertencem aos sorogrupos O1 e O139, por expressarem um dos mais importantes fatores de virulência em V. cholerae, o TCP, reforçando assim a importância de estudos voltados a V. cholerae não-O1/não-O139. Dessa forma, recomenda-se que além dos testes de triagem tradicionais, indispensáveis para a classificação do V. cholerae, sejam realizados métodos moleculares complementares que permitam a identificação de cepas carreando genes de virulência.
Instituição de Fomento: PIBIC/Fiocruz
Palavras-chave: Vibrio cholerae, tcpA, Western Blot.