61ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 13. Parasitologia - 5. Protozoologia de Parasitos

AVALIAÇÃO “IN VITRO” DA INFECTIVIDADE DE AMOSTRAS DE LEISHMANIA (LEISHMANIA) AMAZONENSIS E LEISHMANIA (VIANNIA) GUYANENSIS.

Alana Cristina Vinhote da Silva 1 Liliane Coelho da Rocha Nery 2 Luanda de Paula Figueira 2 Flávia Regina Almeida Campos Naief Moreira 3 Antonia Maria Ramos Franco 4

1. INPA/Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde - Bolsista PIBIC/FAPEAM 2. INPA/Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde - Mestres 3. DCF/ICB/UFAM - DOUTORA 4. INPA/COORDENAÇÃO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - DOUTORA

INTRODUÇÃO:

A leishmaniose tegumentar americana é uma parasitose de ciclo heteroxênico que acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas e caracteriza-se pelo aparecimento de lesões ulcerosas. O agente etiológico é um protozoário do gênero Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) e é transmitido pela picada do inseto vetor, conhecido como flebotomíneo (Hepburn, 2000; Gontijo & Carvalho, 2003). No ciclo de vida do parasito existem basicamente duas formas evolutivas: as promastigotas e as amastigotas. Os parasitas do gênero Leishmania vivem em fagócitos mononucleares – os macrófagos (Rittig & Bogdan, 2000). Sua entrada nas células hospedeiras depende da ação fagocítica dessas células, principalmente através da interação entre receptores celulares do hospedeiro (CR1, CR3, manose-fucose) e moléculas de superfície do microorganismo, os lipofosfoglicanos e a proteases de superfície (gp63) (Zambrano-Villa et al., 2002). O estudo das proteínas envolvidas na infectividade de Leishmania é um campo importante para fornecer dados para estudos protéicos mais avançados. Em vista disso, este trabalho tem como objetivo avaliar “in vitro”, a infectividade de duas espécies de Leishmania, utilizando macrófagos da linhagem J774 e peritoneais obtidos de camundongos BALB/C.

METODOLOGIA:

As células J774 e as de cultivo primário foram mantidas a 37oC com 5% de CO2, em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado. Os testes foram realizados em placas, contendo 106 macrófagos/mL, num volume de 2 mL/poço. Com 24 hs após o plaqueamento dos macrófagos, foi realizada a infecção com cepas de Leishmania provenientes do Laboratório de Leishmaniose e Doença de Chagas/INPA: Leishmania guyanensis (MHO/BR/95/IM4143) infectiva e Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) infectiva e não infectiva. O experimento foi dividido em quatro grupos, de acordo com as diferentes cepas e concentrações. No Grupo I foi usada a concentração de 5x106 dos parasitos de LLa infectiva (LLai) e não infectiva (Lla ni); Grupo II, apenas a Lla ni com 1x108; Grupo III, 5x106 de LVg infectiva (LV i); e no Grupo IV , 1x108 de LVg infectiva (LVg i). Após 4 h de infecção, retirou-se o sobrenadante de todos os poços, renovando-se o meio RPMI. Com 24 hs de infecção, os sobrenadantes foram transferidos para tubos de NNN (Novy et. al., 1904; Nicolle, 1908) e as lamínulas coradas pelo Kit Panótico rápido (Laborclin). Foi realizada a contagem de macrófagos (M) e o número de formas amastigotas interiorizadas. O total de M por grupo foram: I e II - 400 M/amostra; III e IV- 100 M.

RESULTADOS:

Dos macrófagos de linhagem quantificados para cada condição (grupos I, II, III e IV) foi verificado que no I, 15,25% estavam infectados com amastigotas de Llai e nenhum M foi encontrado infectado com a amostra Lla ni. No II apenas 0.5% foram encontradas infectadas, enquanto que no III 11% apresentaram amastigotas interiorizadas e no IV apenas 18%. Nos resultados de amastigotas por M observou-se no grupo I uma média de 1,6 de LLai e zero para Lla ni. Já no grupo II a média foi de um (1) amastigota por M e ainda no grupo III de 1,77 e no IV grupo 3,47 parasitas por M. Esses resultados demonstram que não houve diferença quanto a percentagem de infecção entre as espécies estudadas, enquanto que as diferenças foram observadas dentro de uma mesma espécie entre cepas infectivas e não infectivas, confirmando informações da literatura que apontam que fatores específicos e inespecíficos da resposta imune do hospedeiro estão envolvidos no controle ou progressão da doença, sendo a sobrevida do parasita dependente da capacidade das formas evolutivas evadirem-se de mecanismos adaptativos do hospedeiro vertebrado (Cunningham, 2000).

CONCLUSÃO:

A atividade fagocítica dos macrófagos peritoneais de camundongos mostrou-se muito mais ativa que os de linhagem J774. A compreensão dessa complexa interação entre hospedeiro e parasito poderá influenciar no desenvolvimento de novas estratégias de profilaxia e terapia. Com o estabelecimento da metodologia pra cultivo de macrófagos in vitro é possível a partir de agora recuperar a infectividade de cepas de Leishmania que perderam essa característica devido a seu cultivo in vitro. A obtenção destas cepas é um passo importante para estudos posteriores sobre expressão protéica relacionada a infectividade destes protozoários.

Instituição de Fomento: FAPEAM- Fundação de Amparo à Pesquisas do Estado do Amazonas

Palavras-chave: Leishmania, infectividade, macrófagos MJ774.