60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A cartilagem articular é um tecido avascular, que tem como célula principal o condrócito, e caracteriza-se por ser o único tecido em que a hipóxia é necessária para a sua sobrevivência. O oxigênio nesse tecido atua como um importante modulador da expressão gênica, pois existem evidências que apontam uma forte associação sua a um fator de transcrição: o HIF-1 (fator induzido por hipóxia). O HIF-1 também sofre regulação de fatores de crescimento e citocinas, os quais são importantes na manutenção da homeostase da matriz cartilaginosa. Alterações nos mecanismos de reparo da cartilagem articular levam ao aparecimento de doenças, tais como a Osteoartrite (OA), onde há alteração do gradiente de O₂ ocasionando a perda do equilíbrio da matriz. Portanto, dada à importância dos fatores de crescimento e do HIF-1α na cartilagem normal e, possivelmente, na cartilagem osteoartrítica, resolvemos estudar a expressão desse fator de transcrição quando estimulado pelo IGF-1 (um fator de crescimento) nos condrócitos normais e osteoartríticos.

METODOLOGIA:

Os condrócitos foram obtidos a partir das cartilagens articulares de pacientes com osteoartrite de joelho submetidos à cirurgia de prótese total de joelho e as amostras de cartilagem normal de pacientes submetidos à amputação total do membro inferior. Primeiramente foi realizado o isolamento dos condrócitos normais e osteoartríticos por meio de células cultivadas em suspensão em placas. Em cada placa foram colocadas 3x10⁶ a 5x10⁶ células. Os condrócitos foram estimulados com o fator de crescimento insulina-like 1 (IGF1). Após esse procedimento foi realizada a extração de proteínas nucleares, sua quantificação e análise por Western Blott. Os blots foram revelados com o kit de detecção ECL e foram feitas em seguida as auto-radiografias, a extração de RNA, a síntese de cDNA e a reação em cadeia de polimerase em Tempo Real (PCR-RT). As amostras de cDNA foram sintetizadas a partir do RNA total usando o sistema de Transcrição Reversa com primers hexâmeros randômicos. Foram desenhados primers sense e antisense para os genes HIF-1A e ACTB, que codificam as proteínas HIF-1alfa e beta-actina, respectivamente. As condições de ciclagem seguiram as especificações do equipamento 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystem).

RESULTADOS:

Observou-se que a expressão do HIF-1 alfa aumenta em condrócitos estimulados com o IGF-1, no nível protéico, o que se verificou através de vários experimentos utilizando-se do método de Western Blott. O mesmo, no entanto, não se verificou em relação aos níveis de mRNA. Estes achados sugerem que o aumento dos níveis protéicos encontrado, estaria relacionado a fatores pós-transcricionais, como já verificado em relação à modulação deste fator de trancrição, tanto pelo TNF-alfa quanto pela IL-1 beta. Além disto, com o intuito de analisar quais as possíveis vias de sinalização que seriam ativadas para esta ação, começamos a realizar os experimentos com o IGF-I em condrócitos previamente tratados com um inibidor da MAPK p38: mitogen-activated protein kinase p38 ou com inibidor da PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase), pois dessa forma estaríamos analisando pelo menos duas vias de sinalização do HIF-1 alfa já conhecidas.Os resultados observados apontam somente que o IGF-1 estimula o aumento do acúmulo do HIF-1 alfa através da via da PI-3K.

CONCLUSÕES:

Pudemos constatar, portanto, que o IGF-1 estimula o HIF-1 alfa por meio da via da PI-3K como havíamos previsto, porém não temos ainda dados conclusivos sobre o estímulo do HIF-1 alfa pelo IGF-1 utilizando a outra via de sinalização (MAPK p38).

Instituição de fomento: PIBIC/CNPq

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Condrócitos, IGF-1, HIF-1

E-mail para contato: daniargolo@gmail.com