60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

As hemofilias A e B são doenças hereditárias causadas pela deficiência dos fatores de coagulação sangüínea VIII e IX, respectivamente, no plasma sangüíneo. Até o momento, não tem cura, mas tem tratamento. Os fatores recombinantes VIII e IX de coagulação sangüínea constituem medicamentos bastante seguros para o tratamento de indivíduos portadores de Hemofilia A e B, respectivamente. Em alguns países como Canadá e Irlanda representam a única fonte de tratamento para esses pacientes e vêm sendo utilizados não apenas como terapia, assim como profilaxia. No Brasil, os hemofílicos são tratados com os fatores VIII ou IX purificados a partir do plasma de indivíduos saudáveis. Essa estratégia é inadequada devido ao risco de infecções virais e a necessidade de uma grande demanda de plasma de doadores sangüíneos normais. A primeira etapa para a geração de um produto biotecnológico consiste na construção de um banco de moléculas recombinantes, seguida da geração de um banco de linhagens celulares recombinantes utilizando diferentes vetores de expressão para investigação da estratégia de produção mais adequada da proteína de interesse. Neste contexto, o objetivo do presente estudo consistiu em desenvolver diferentes moléculas recombinantes relativas aos fatores VIII e IX de coagulação sangüínea utilizando vetores plasmidiais convencionais e virais, seguida da transfecção em linhagens celulares de mamífero para a seleção da linhagem celular mais promissora de produção das proteínas de coagulação sangüínea humana.

METODOLOGIA:

O procedimento utilizado para a otimização da linhagem celular mais adequada de expressão da proteína recombinante consistiu em avaliar 4 parâmetros distintos: 1) tipo de molécula recombinante (inteira; deleção do domínio B com fusão das cadeias pesadas e leves e deleção do domínio B com a co-expressão das duas cadeias do fator VIII); 2) adição de elementos promotores de transcrição gênica (CMV, pFVIII, pHAAT, pEF1a e LTR); 3) adição ou não de elementos ativadores de transcrição gênica (HCR-1 e HCR-2) e 4) estratégia de seleção da linhagem celular recombinante (citometria de fluxo [GFP], antibiótico geneticina e drogas quimioterapêuticas). As moléculas recombinantes foram geradas pelo ensaio de amplificação em cadeia da DNA polimerase a partir de um DNA plasmidial convencional portador das moléculas inteiras. Em seguida, foi realizado o seqüenciamento do DNA para a confirmação da seqüencia esperada e posteriormente as construções plasmidiais recombinantes foram transfectadas nas distintas linhagens celulares. Após a transfecção foi realizada a seleção da linhagem celular transgênica por uma das técnicas acima mencionadas para obtenção de uma população celular com expressão estável dos fatores recombinantes. Por fim, cada linhagem foi caracterizada no que diz respeito ao nível de expressão do mRNA relativo ao fator VIII, a atividade biológica do fator VIII presente no sobrenadante dessas culturas e a caracterização bioquímica da proteína do FVIII presente no sobrenadante dessas linhagens celulares.

RESULTADOS:

Foi gerado um banco de 15 construções recombinantes, 14 relativas ao fator VIII e 1 relativa ao fator IX de coagulação sangüínea humana. Destas construções, 8 foram realizadas em vetores plasmidiais convencionais e 7 em vetores virais. Cinco linhagens diferentes foram transfectadas com 8 construções plasmidiais convencionais portadoras do cDNA relativo ao FVIII o que resultou em 20 linhagens transgênicas. Todas mostraram a expressão do mRNA relativo ao FVIII por RT-PCR convencional, mas apenas três delas mostraram atividade biológica igual ou 1,6 vezes superior a quantidade de FVIII presente no plasma sangüíneo que é da ordem de 1 IU/mL. Outras sete linhagens celulares foram transfectadas com vetores lentivirais ou retrovirais resultando em 20 linhagens transgênicas. Em todas foi mostrada a expressão do mRNA relativo ao fator VIII por RT-PCR convencional. Destas, 7 linhagens mostraram níveis de fator VIII de 1,8-7,3 vezes superiores a quantidade de FVIII presente no plasma sangüíneo. Duas dessas foram selecionadas para estudos futuros por apresentarem níveis de atividade biológica do fator VIII da ordem de 5 IU/ mL e 7,3 IU/mL. Com relação a molécula recombinante relativa ao fator IX foi gerada uma única construção portadora do FIX inteiro e 3 linhagens transgênicas. A expressão do Fator IX foi detectada apenas nas linhagens celulares humanas e os níveis de atividade biológica foram da ordem de 2,7-11 IU/mL.

CONCLUSÕES:

Linhagens celulares humanas modificadas por vetores virais expressam níveis dos fatores recombinantes VIII e IX da coagulação sangüínea humana 7 a 11 vezes superiores quando comparado com o sistema plasmidial convencional, constituindo uma estratégia mais promissora para a expressão estável de proteínas recombinantes.

Instituição de fomento: FAPESP, CNPq e FINEP.

Palavras-chave: Fatores recombinantes VIII e IX coagulaç, Hemofilia A e B, sistemas lentivirais e retrovirais

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