60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

A disposição irregular de resíduos industriais e domésticos nos leitos de rios promove a proliferação de resíduos tóxicos, colocando em risco a saúde pública e a qualidade dos ecossistemas. Alguns poluentes naturais podem provocar a eutrofização artificial de corpos d’água, induzindo a floração de cianobactérias tóxicas como Microcystis aeruginosa. M. aeruginosa é produtora de peptídeos não ribossômicos tóxicos (microcistinas), para os quais se tem relatos de morte por exposição aguda e/ou crônica. Recentemente cientistas também associaram a floração dessas bactérias ao aquecimento global, evidenciando mais uma conseqüência da degradação ambiental. Microcistinas são uma família de cianotoxinas com várias isoformas, dentre as quais, microcistina-LR apresenta alta toxicidade para animais. A floração de cianobactérias tóxicas gera custos altíssimos para sistemas de tratamento de água, especialmente para países em desenvolvimento, sendo, pois um problema de saúde mundial. Como uma alternativa aos métodos hoje utilizados para monitoramento da presença de cianotoxinas em reservatórios e águas de abastecimento, este trabalho demonstra que é possível a construção de um biossensor utilizando a interação anticorpo-antígeno acoplado à microscopia de força atômica (AFM).

METODOLOGIA:

O microscópio de força atômica ThermoMicroscope AutoProbe CP (EUA) foi utilizado para medidas topográficas e de curvas de força. Medidas topográficas foram obtidas nos modos não contato, utilizando ponteiras normais e no modo contato intermitente com ponteiras funcionalizadas. Curvas de força foram obtidas no modo contato com ponteiras normais e funcionalizadas em tampão fosfato de sódio, pH 7,4. Para funcionalização das ponteiras, anticorpos específicos para microcistina (Microcystin Tube Kit – Beacon Analytical Systems) foram acoplados em ponteiras de Si₃N₄ (Veeco). Ponteiras foram esterilizadas sob luz ultravioleta e tratadas com vapores de trietilamina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e do reagente aminopropil-trietoxi silano (APTES, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em um sistema apropriado para lavagem com argônio. Ponteiras modificadas com APTES foram posteriormente aciladas com glutaraldeído e incubadas com anticorpos. Amostras para análise foram prepapradas de forma semelhante, utilizando o substrato mica muscovita (New York Co. EUA), sendo posteriormente incubadas com microcistina LR. Todos os tratamentos foram intercalados por 3 lavagens com água (Milli-Q). Após a última lavagem o material foi seco e armazenado em um dessecador sob atmosfera de argônio até análise.

RESULTADOS:

Os estudos topográficos revelaram que durante a varredura no modo não contato houve arraste do material presente na superfície da mica, caracterizando uma forte atração entre a ponteira funcionalizada com anticorpo e a superfície (antígeno ligado à mica). Concluimos que, devido a interações eletrostáticas, a força de atrito na varredura fez com que o modo de não-contato fosse anulado passando, portanto, para o modo de contato intermitente. Pode-se concluir neste tipo de análise, que houve a formação de um biosensor eficiente devido a uma boa imobilização do anticorpo na ponteira e da aderência de microcistina sobre a mica. A análise de freqüência da amostra gerou informações das quais se pode inferir que na redução da oscilação da amplitude em sítios mais baixos dos gráficos gerados ocorre um evento de interação específica entre antígeno e anticorpo. Para uma análise rápida, foram feitas curvas de força de adesão, com informações que comprovaram a interação viscoelástica entre antígeno e anticorpo. Na curva de força de repulsão, as camadas presentes na amostra não resistiram à oscilação vertical da ponteira e em conseqüência disso, nota-se que a toxina não apresenta uma estrutura muito dura, tendo, portanto uma elasticidade de baixa a média.

CONCLUSÕES:

O método utilizado desde a funcionalização das ponteiras até obtenção das curvas de força tem duração de aproximadamente 40 minutos. Entretanto, se os materiais já estiverem esterilizados, esse tempo diminui para 10 minutos. Após a exposição da mica ao APTES, ela pode permanecer em um dessecador selado até quando for necessária por um período de até 2 meses. Assim, uma vez preparada uma boa quantidade de amostras, a detecção da toxina pode ser realizada em até 5 minutos. Os estudos topográficos, estatísticos e de freqüência que foram utilizados comprovaram a qualidade do acoplamento de anticorpos específicos para microcistina-LR nas ponteiras utilizadas. Curvas de força podem ser utilizadas para auxiliar na análise de dados sobre o tipo do material presente nas ponteiras e superfícies. Neste trabalho, observa-se que as curvas de força também levam a informações sobre a elasticidade da toxina, podendo abrir portas para a descoberta de novos métodos de degradação de microcistinas. Os imunoensaios diretos aplicados à detecção e quantificação de poluentes tóxicos no ambiente ainda são poucos, e muitas vezes ineficientes. O método descrito, bem como as ferramentas de análise, provam a proficuidade do estudo para aplicações em diversas análises ambientais.

Instituição de fomento: CNPq, Fapesp, Fapic (PUC-CAMPINAS)

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Microcistina, Microscópio de Força Atômica, Peptídeos não-ribossômicos

E-mail para contato: carolcastrob@gmail.com