60ª Reunião Anual da SBPC

INTRODUÇÃO:

O fungo Lasiodiplodia theobromae é um fitopatógeno que causa várias doenças em diversos hospedeiros, promovendo perdas consideráveis na produtividade das plantas. Provavelmente, nenhum outro microrganismo representa uma maior ameaça à fruticultura no nordeste do que o fungo L. theobromae, pelo caráter destrutivo dos sintomas por ele provocados, além da sua disseminação assintomática através de sementes, propágulos vegetativos e porta-enxertos. Este fungo afeta mais de uma dezena de plantas frutíferas no Brasil, dentre elas a mangueira, o cajueiro, as anonáceas, o coqueiro, as Spondias, a bananeira, a aceroleira e o sapotizeiro, provocando perdas desde o vigor de sementes até a vida de prateleira pós-colheita. Ademais, nenhum método de controle da resinose tem se revelado eficiente sob condições práticas ou experimentais. A cirurgia total do cancro e/ou a poda dos ramos infectados, seguido da aplicação de uma pasta fungicida à base de cobre, só se mostra efetiva quando a área lesionada for limitada. Em função da importância dessas doenças e da dificuldade do seu controle, faz-se necessário a utilização de novas ferramentas para o estudo da interação patógeno-hospedeiro, visando o manejo adequado da doença. Nesse sentido, o presente trabalho teve por objetivo definir um protocolo de extração de proteínas para análise em eletroforese bidimensional.

METODOLOGIA:

Os isolados dos fungos foram crescidos em placas de Petri contendo meio asséptico BDA. Depois de crescidos, procedeu-se a repicação dos isolados até a obtenção de culturas puras. Após a purificação, fez-se a transferência para meio de cultivo líquido, com a finalidade de formar mantas dos fungos, facilitando, a extração de proteínas. Após o crescimento dos isolados em meio líquido, as mantas foram filtradas a vácuo, seguida de uma maceração com nitrogênio líquido e liofilizados, obtendo-se, o pó de onde foram extraídas as proteínas. Utilizou-se, como ponto de partida para definição dos padrões eletroforéticos o protocolo proposto por Damerval (1986) com pequenas modificações para adequar-se a extração do material fúngico. Primeiramente, realizou-se a extração utilizando o protocolo original, no qual o material liofilizado foi extraído com TCA 10%, DTT 0,07% em acetona gelada, homogeneizado por 1 min em agitador e colocado em repouso por 2 horas à –20 ºC. Após esse período foi centrifugado a 14.000 x g por 30 minutos a 6 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado três vezes com acetona gelada. O precipitado final foi recolhido, secado e armazenado a -20ºC. Os ajustes foram feitos retirando o DDT do processo de extração, reduzido o tempo de precipitação, rotação, centrifugação e o número de lavagens, obtendo o pó protéico.

RESULTADOS:

Para os ajustes da metodologia de Damerval (Electrophoresis, 7:52-54, 1986), o DDT foi retirado do processo de extração, seguido da redução em uma hora do tempo de precipitação, redução da rotação para 9.600 x g e do tempo de centrifugação para 15 minutos. Reduziu-se ainda o número de lavagens, obtendo-se o pó protéico como descrito a seguir. Cerca de 1g do material liofilizado foi adicionado a uma solução de ácido tricloroacético (TCA) a 10% em acetona gelada, homogeneizado por 1 min em agitador (mixer) e colocado em repouso por 1 hora à –20 ºC. Após esse período foi centrifugado a 9.600 x g por 15 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com acetona gelada e centrifugado a 9.600 x g por 15 minutos. O precipitado final foi recolhido, secado em um dessecador com sílica gel e armazenado a -20ºC para posterior análise.

CONCLUSÕES:

O protocolo ajustado para extração de proteínas mostrou-se eficiente para o material fúngico, obtendo-se géis eletroforéticos adequados para análise proteômica.

Instituição de fomento: FINEP/FUNCAP

Trabalho de Iniciação Científica

Palavras-chave: Lasiodiplodia theobromae, proteoma, caju

E-mail para contato: rebeca.maia@gmail.com