| D. Ciências da Saúde - 5. Farmácia - 2. Analise Toxicológica |
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PADRONIZAÇÃO IN VITRO DA TÉCNICA DO MICRONÚCLEO EM CÉLULAS VERO PARA DETECÇÃO DE GENOTOXICIDADE |
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| Deise J. Kolling 1, 3 |
| Jadel M. Kratz 1, 3 |
| Célia R. M. Barardi 2, 3 |
| Cláudia M. O. Simões 1, 3 |
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| (1. Departamento de Ciências Farmacêuticas, CIF / CCS; 2. Departamento de Microbiologia e Parasitologia / MIP / CCB; 3. Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC / LVA) |
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| INTRODUÇÃO: |
Genotoxicidade é a capacidade que algumas substâncias têm de induzir alterações no material genético de organismos a elas expostos, e essas alterações são responsáveis pelo surgimento de cânceres e doenças hereditárias. Os diferentes testes genotóxicos detectam mutações gênicas e cromossômicas. Dentre eles, o teste do micronúcleo fornece informações primárias, em nível cromossômico, sobre os danos no DNA causados por agentes químicos e físicos. Os micronúcleos originam-se de fragmentos cromossômicos acêntricos (efeito clastogênico) ou de cromossomos inteiros que não completam a migração anafásica da divisão celular (efeito aneugênico). O conhecimento do potencial genotóxico de um fármaco ou de compostos presentes no meio ambiente é uma informação essencial para as agências regulatórias, no que se refere ao estabelecimento de riscos para o homem e o ambiente.
OBJETIVO: Este trabalho teve como objetivo padronizar a técnica do micronúcleo in vitro em células VERO no Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC, com a finalidade de utilizá-la como ferramenta para a detecção do potencial genotóxico de compostos sintéticos e de origem natural. |
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| METODOLOGIA: |
Iniciou-se a padronização da referida técnica com o cultivo, a hipotonização e a fixação das células nas lâminas de microscopia. As células VERO (1,5 x 104 células/mL) foram cultivadas em meio MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos/antifúngico, em placas estéreis de polipropileno de 24 cavidades e tubos plásticos estéreis de 30 mL. A hipotonização foi feita com KCl 75mM, e variou-se o tempo (2, 5, 7 e 10 min) e a temperatura de contato (ambiente e 4oC) do mesmo com as células. A fixação foi realizada com metanol puro e com solução metanólica de formaldeído a 0,75%. Após, foram testados cinco corantes para auxiliar a visualização microscópica das lâminas (Giemsa, Hematoxilina-Eosina, Acridine Orange, Feulgen-Fast Green e Brometo de Etídio). |
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| RESULTADOS: |
O cultivo das células foi melhor obtido nos tubos de 30mL. A hipotonização mais adequada foi obtida a 4oC por 2 min. A fixação das células nas lâminas foi igualmente eficiente com os dois reagentes, tendo-se escolhido, então, o metanol puro. Entre os corantes utilizados, os que propiciaram melhor visualização celular e dos micronúcleos foram: Giemsa 4% (microscópio invertido 100X – núcleos e micronúcleos com coloração roxa e citoplasma rosa), Acridine Orange (125μg/mL em PBS pH 6,8) (microscópio de fluorescência, 40X – núcleos e micronúcleos com cor verde e citoplasma laranja), Brometo de Etídio (1μg/mL) (microscópio de fluorescência, 40X - cora apenas o DNA de vermelho, tendo sido possível observar núcleos e micronúcleos). |
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| CONCLUSÕES: |
As variáveis foram selecionadas conforme explicitado acima, e o corante Acridine Orange foi escolhido por proporcionar a melhor imagem das células, estando essas mais nítidas e com definição e diferenciação do citoplasma e dos núcleos e micronúcleos, facilitando assim a contagem dos últimos. Desta forma, a técnica assim padronizada poderá ser usada para a determinação da genotoxicidade de compostos no Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC.
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Instituição de fomento: PIBIC/UFSC e CNPq.
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: genotoxicidade; micronúcleos; células VERO. |
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| Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |
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