A modificação pós-traducional de proteínas dependente de ubiquitina e de outras proteínas similares é um mecanismo regulatório essencial em diversos processos biológicos. Esta via de modificação é um processo dinâmico, reversível e controlado pela ação de múltiplas enzimas distintas. A conjugação da ubiquitina e moléculas relacionadas é catalizada pela ação sucessiva de três tipos de enzimas: a ativadora de ubiquitina (E1), conjugadora (E2) e ligase (E3). A conjugação das proteínas semelhantes a ubiquitina, como por exemplo a SUMO aos seus respectivos substratos alvo, também envolve uma cascata enzimática similar. Considerando que uma das características marcantes do Trypanosoma cruzi é a grande heterogeneidade tanto genômica como fenotípica, entre as cepas e também clones da mesma cepa, entendemos que este parasito constitui não só um bom modelo para avaliar a relevância biológica dos ciclos de ubiquitinação/sumorilação como também um bom exemplo de um organismo onde alterações nestas vias de modificação pós-traducional poderiam influenciar comportamentos biológicos como taxa de crescimento, patogenicidade e susceptibilidade à drogas. De modo a estabelecer estas correlações, este trabalho teve como objetivo principal analisar o perfil do conjugados ubiquitinados e sumorilados em extratos totais de epimastigotas de T. cruzi I (cepa Colombiana) e T. cruzi II (CL, CL-Brenner, Berenice-62, Berenice-78 e Y).

Extratos totais obtidos de epimastigotas de T. cruzi I (cepa Colombiana) e T. cruzi II (CL, CL-Brenner, Berenice-62, Berenice-78 e Y) foram fracionados em gel de poliacrilamida 10% e a seguir, transferidos para membrana de nitrocelulose. Os conjugados ubiquitinados foram identificados, utilizando como anticorpo primário, anti-ubiquitina de boi produzidos em coelhos (na diluição 1:500), seguida de incubação com anticorpo secundário anti-imunoglobulina G de coelho biotinilado (1:1000) e, posteriormente, com estreptoavidina conjugado à fosfatase alcalina. Para a detecção dos conjugados, utilizamos nitroblue tetrazoluim (NTB) e bromocloroindol fosfato (BCIP). Os conjugados sumorilados foram detectados utilizando anti-sumo (1:500), nas mesmas condições descritas acima. Também avaliamos por Western Blot os níveis de proteassoma, utilizando anticorpos específicos anti- alfa (Affinit). As atividades peptidásicas semelhante a caspase, tripsina e quimotripsina foram avaliadas utilizando susbtratos sintéticos e preparações enriquecidas de proteassomas, das cepas em estudo, obtidos por sub-fracionamento celular.

Os nossos resultados mostram um padrão distinto tanto de conjugados ubiquitinados como sumorilados nas diferentes cepas de T. cruzi. Também observamos acúmulo de conjugados ubiquitinados na cepa Berenice-78 e sumorilados na cepa ABC, quando comparados às cepas CL, CL-Brener, Berenice-62, Colombiana e Y. Também detectamos uma grande variação na atividade peptidásica dos proteassomas obtidos das cepas de T. cruzi I e II, não apresentando co-relação com os níveis de proteassomas detectados por Western blot.

Os resultados obtidos sugerem que a via de proteolítica dependente de ubiquitina e proteassoma 26S apresenta uma regulação diferenciada entre cepas do grupo T. cruzi I e II. Os nossos próximos experimentos terão como objetivo determinar a contribuição da fosforilação e glicosilação na modulação da atividade dos proteassomas em T. cruzi.