O proteassoma 20S é um complexo enzimático com 750kDa apresentando uma estrutura composta por quatro anéis superpostos com sete subunidades cada um, num arranjo alfa7, beta7, beta7, alfa7, onde as subunidades do tipo alfa apresentam função estrutural e as betas catalíticas, com atividades peptidásicas semelhantes a caspase, tripsina e quimiotripsina (beta 1,2 e 5 respectivamente). A forma predominante do proteassoma encontrado em eucariotos inferiores é o proteassoma 26S, cujo papel principal é a degradação de proteínas tanto de uma maneira dependente quanto independente de ubiquitina. Recentemente foi descrito que a inibição do proteassoma em T. cruzi inibe a transformação de tripomastigota em amastigota. Apesar destas evidências, tanto a organização genômica quanto o padrão de expressão destes genes nas diferentes fases evolutivas deste parasita ainda permanece para ser compreendida. Diante destas considerações este projeto tem por objetivo principal determinar o padrão de expressão e avaliar a atividade quimotripsina do proteassoma 20S na forma epimastigota em formas epimastigotas de T. cruzi I (cepa Colombiana) e T. cruzi II (CL, CL-Brenner, Berenice-62, Berenice-78 e Y).

Para identificar genes codificadores da subunidade quimotripsina-simile do proteassoma 20S, utilizamos o algoritmo BLAST para triar as entradas nos bancos de dados procurando por seqüências de DNA que codifiquem proteínas similares a membros previamente descritos desta família. A seguir, nós examinamos por RT-PCR semi-quantitativo o padrão de expressão da subunidade beta-5 em formas epimastigotas de T. cruzi I (cepa Colombiana) e T. cruzi II (CL, CL-Brenner, Berenice-62, Berenice-78 e Y) utilizando oligunucleotídeos específicos, desenhados com base nas seqüências recuperadas dos bancos e RNA total, extratído utilizando o método do Trizol. A atividade peptidásica associada a subunidade quimotripsina foi avaliada usando o susbtrato sintético SLLVT-MCA e preparações enriquecidas de proteassomas obtidos por sub-fracionamento celular.

Usando dados do projeto genoma do T. cruzi (TcruziDB http://TcruziDB.org), nós identificamos dois clusters homólogos ao gene beta 5, que codifica a subunidade quimotripsina-simile do proteassoma 20S. Estas subunidades contem 936 bases e codifica 311 aminoácidos e um peso molecular de 34,2 kDa. A seqüência predita de aminoácidos compartilha 83 e 70% de identidade com Trypanosoma brucei e Leishmania major. Os nossos resultados de RT-PCR mostram a existência de um padrão similar de expressão do gene beta 5 em formas epimastigotas de T. cruzi I (cepa Colombiana) e T. cruzi II (CL, CL-Brenner, Berenice-62, Berenice-78 e Y). Entretanto, encontramos diferenças significativas da atividade peptidásica associada á estas cepas.

Esses resultados sugerem a existência de pelo menos duas cópias por genoma haplóide do gene beta 5 em T. cruzi. Além disso, os resultados obtidos até o momento mostram evidências de que a atividade quimotripsina do proteassoma 20S deste parasito pode ser modulada por modificações pós-traducionais de uma forma mais eficiente do que uma regulação ao nível transcricional. Esta hipótese será investigada através de estudo da região promotora do gene beta 05.