A elucidação do papel das enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares, chamadas de ecto-nucleotidases, é importante para a compreensão da interação parasito-hospedeiro. Uma ecto-NTPdifosfohidrolase (NTPDase) foi isolada (Fietto, JLR et al., 2004) e sua atividade foi caracterizada na superfície de parasitas intactos de Trypanosoma cruzi. Essas enzimas hidrolisam nucleotídeos extracelulares tri e di fosfatados – moléculas regulatórias envolvidas em diferentes processos biológicos como: proliferação, diferenciação e adesão celular, resposta imune e sinalização purinérgica. Sugerimos que em T. cruzi a virulência e infectividade possam estar relacionadas com uma maior capacidade ecto-nucleotidásica. Além disto, como estes parasitas são deficientes na via de biossíntese "de novo" de purinas, sendo dependentes da chamada "via de salvação", propomos que estas enzimas possam também participar do processo de aquisição de purinas do meio extracelular. Neste contexto, nossos objetivos são avaliar a co-relação real entre a capacidade ectonucleotidásica geral e dependente da NTPDase I das diferentes formas evolutivas do parasita (cepasY, CL, Be-62 e clones CL-Brener e CL-14) e fatores relacionados com a infectividade e virulência em infecções experimentais "in vitro" e "in vivo". A comprovação destas hipóteses e o conhecimento dos processos relacionados com a atividade destas enzimas podem ser de extrema importância para uma abordagem quimioterápica ou imunoterápica futuras.

Os testes de infectividade "in vitro" foram feitos em cultura de células VERO crescidas em lamínulas redondas de vidro (13 mm). Após crescimento prévio das células, estas foram infectadas com tripomastigotas da cepa Y (cepa padrão de alta infectividade) numa proporção de 10 parasitas por célula. Após 24 horas pós-internalização, o meio de cultura (RPMI complementado com soro fetal bovino, garamicina, Hepes 1M e L-glutamina) foi removido e novo meio isento de parasitas foi adicionado. As lamínulas foram retiradas da placa de cultura 24 e 48 horas pós-infecção e então levadas para coloração com Giemsa a lento. Nós também avaliamos a atividade ecto-nucleotidase dos tripomastigotas, epimastigotas e amastigotas intactos de diferentes cepas (Y, CL, Be-62 e clone CL-Brener) mantidos em cultura celular (céls. VERO) ou axênica (meio LIT). Para dosagem de atividade os parasitas foram recuperados e concentrados em 1x10⁸ céls./ml em tampão de atividade 1X. Esse ensaio foi realizado em eppendorfs, num volume total de 125µl (tampão de atividade 5X, ATP, ADP ou AMP, parasitas, H₂O milliQ), durante 1h a 37°C. A reação foi interrompida com TCA 10% e uma alíquota foi transferida para outro tubo contendo reativo de cor e molibidato de amônio. Após 30 min de incubação foi realizada a leitura (por absorbância) da quantidade de Pi usando-se o aparelho COBAS FARA. Também foi avaliada a atividade ecto-nucleotidase da cepa Y (tripo, epi e ama) durante passagens celulares "in vitro" (céls. VERO).

Na primeira passagem celular, uma elevada capacidade infectiva foi observada na cepa Y, e baixa em Be-62 e CL-Brener. A atividade ecto-ATPase foi significativamente maior nos tripomastigotas (infectantes) com perfil de decréscimo Y>CL>CL-Brener>Be-62. A hidrólise de ADP foi similar em todas as cepas, exceto para Y, mostrando baixa hidrólise. A razão de hidrólise ATP/ADP dos tripos foi diferente para algumas cepas (25:1, 2:1, 3:1, 3:1, 2:1 para Y, CL, CL-Brener e Be-62, respectivamente). Atividade AMPase somente detectável em CL-Brener. Os amastigotas mostraram clara preferência para ATP em todas as cepas, hidrólise de ADP não detectável (cepa CL) ou muito baixa (cepa Y), e somente a cepa Y apresentou atividade AMPase. Os epimastigotas (cepa Y) apresentaram atividade ATPase similar aos amastigotas. A atividade ecto-nucleotidase (Y) durante passagens celulares em céls. VERO mostrou que, durante quatro passagens celulares a atividade ecto-ATPase permaneceu constante, a ecto-ADPase aumentou e a ecto-AMPase não foi detectável. Cerca de 80% dos tripos da 3ª pasagem não penetraram nas céls. VERO diferenciando-se para forma amastigota-like extracelular. Estes apresentaram baixa atividade ect-nucleotidase comparado com prévias passagens. Juntos nossos dados sugerem uma relação entre alta atividade ecto-nucleotidase e capacidade infectiva. A elevada atividade ecto-ATPase e a geração de adenosina poderiam estar relacionadas com maior capacidade infectiva apresentada neste trabalho.

A hidrólise de ATPe foi significativamente maior nas formas infectivas das diferentes cepas testadas. Tanto a relação de hidrólise ATP/ADP quanto a hidrólise de AMP foram diferenciadas, possivelmente relacionadas com diferenças no comportamento biológico, como, capacidade diferenciada de modular o sistema imune. Parece haver um aumento na taxa de hidrólise de ADP pelos tripos durante a manutenção em meio celular, ademais, foi detectada atividade ecto-nucleotidásica solúvel (possivelmente secretada pelo parasita). Após a 3ª passagem em cultura celular apenas uma pequena porção dos parasitas foram capazes de infectar as células. Da 3ª para a 4ª passagem houve uma mudança morfológica dos parasitas – tripomastigota para "amastigota-like" – tornando-se incapazes de infectar as células hospedeiras. Esses "amastigota-like" apresentaram menor capacidade ecto-nucleotidásica com relação aos tripomastigotas, sugerindo um correlação entre estes fenômenos. Poucos parasitas foram recuperados após a infecção da 4ª passagem, e estes apresentaram um perfil de atividade similar ao dos tripomastigotas das passagens anteriores. Não foi possível dar continuidade às passagens em cultura devido ao número limitado de parasitas recuperados.