C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular |
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ANÁLISE MOLECULAR DE DUAS APIRASES DE Leishmania (ISOFORMAS DO TIPO NTPDase E GDPase), CLONAGEM EM VETORES DE EXPRESSÃO HETERÓLOGOS E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE L. major. |
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Murilo Sena Amaral 1 |
Juliana Silva Martins da Costa 1 |
Luís Carlos Crocco Afonso 1 |
Ricardo DeMarco 2 |
Sérgio Verjovski-Almeida 2 |
Juliana Lopes Rangel Fietto 3 |
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(1. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – UFOP MG; 2. Instituto de Química – USP –SP; 3. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – UFV MG) |
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INTRODUÇÃO: |
Leishmania major tem dois genes de apirases mapeados em seu genoma, denominados NTPDase e possível guanosina difosfatase (números de acesso BK005083 e AL359683, respectivamente). Por outro lado, L. amazonensis e L. brasilienses não possuem esses genes identificados. A função das apirases, caracterizada como a capacidade de hidrólise de tri e dinucleotídeos, insensível a inibidores de outras ATPases, foi previamente demonstrada em células intactas de L. amazonensis, L. brazilienses (Maioli et al, 2004) e L. major (dados não publicados). Tem-se sugerido que essa capacidade ecto-nucleotidásica esteja envolvida com a virulência e o controle da resposta imune do hospedeiro pela Leishmania (Maioli et al, 2004). |
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METODOLOGIA: |
A fim de avaliar se as diferenças moleculares poderiam explicar esses dados, foram desenhados primers e ambos os genes nessas três espécies foram amplificados, clonados no vetor de amplificação TOPO a fim de que fossem seqüenciados e clonados nos vetores de expressão bacteriano pET21b e de levedura pYES a fim de que se obtivesse proteínas recombinantes. A identidade dos genes isolados foi avaliada por sequenciamento automático de DNA e análises de BlastX. |
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RESULTADOS: |
Comparações moleculares in silico entre as proteínas deduzidas de Leishmania major mostraram somente uma possível região transmembrana no domínio N-terminal de ambas as possíveis apirases. Além disso, a possível GDPase tem um peptídeo de sinal no aminoácido de posição 45 (predito pelo programa SIGNAL P), sugerindo uma possível proteína excretada solúvel. De outro modo, o possível domínio N-terminal transmembrana na NTPDase e a presença de atividade ecto-apirásica em células vivas do parasito é sugestivo de uma ecto-localização na membrana. Apesar de ambas as proteínas preditas possuírem RCA’s (Regiões Conservadas de Apirase), o alinhamento entre essas proteínas preditas revelou uma identidade muita baixa (19,9%). A análise parcial dos genes e das proteínas deduzidas de L amazonensis e L. braziliensis mostrou uma identidade de 100% em ambos os níveis (DNA e proteína) com as isoformas de L.major. |
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CONCLUSÕES: |
Até então os resultados sugerem que as diferentes capacidades ecto-nucleotidásicas nas três espécies de Leishmania não podem ser explicadas em nível molecular. A confirmação desses dados pelo sequencimento total dos genes das apirases e análise dos perfis de expressão e localização celular das apirases serão as próximas etapas nessa investigação. Além disso, a expressão heteróloga e purificação da GDPase e NTPDase de L.major estão sendo realizadas e as caracterizações bioquímicas dessas proteínas poderão elucidar o real papel dessas apirases na capacidade ecto-nucleotidásica de Leishmania. |
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Instituição de fomento: UFOP, FAPEMIG, CNPq e MEC
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Trabalho de Iniciação Científica
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Palavras-chave: Ecto-nucleotidases; Leishmania; apirase. |
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Anais da 58ª Reunião Anual da SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006 |