64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL DE ESPÉCIES DE PEIXES MARINHOS

Solange Frazão de Almeida 1 Pâmella Silva de Brito 2 Jorge Luis Silva Nunes 3 Luis Fernando Carvalho Costa 4

1. Graduanda em Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias e Ambientais - UFMA 2. Mestranda em Biodiversidade e Conservação – UFMA 3. Prof. Dr./ Centro de Ciências Agrárias e Ambientais – UFMA 4. Prof. Dr./ Orientador - Centro de Ciências Agrárias e Ambientais - UFMA

INTRODUÇÃO:

O DNA é a molécula mestra da célula, em cuja estrutura está codificada toda informação necessária para criar e comandar a maquinaria química da vida. Portanto, torna-se crucial para o desenvolvimento de pesquisas no campo da Biologia Molecular, o estudo de técnicas de purificação de DNA. Para desenvolver um rápido e eficiente protocolo de extração de DNA genômico, a partir de diferentes materiais, é muito importante focar na qualidade e quantidade do DNA que servirá como molde para experimentos posteriores. Para isso, é importante pesquisar a eficiência de métodos de extração de DNA que possam ser rápidos, práticos, baratos, livres de contaminação e de toxicidade, e eficazes no que tange à quantidade, qualidade e a possibilidade de amplificação in vitro de segmentos genômicos a partir deste DNA. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar os rendimentos, quanto à qualidade e à quantidade, na extração de DNA, a partir de tecidos de peixes marinhos, utilizando três metodologias: método do tampão salino, método do Fenol/Clorofórmio e por Kit comercial.

METODOLOGIA:

Foram extraídos DNAs de amostras de tecido de nadadeira caudal de cinco espécimes de duas espécies de peixes marinhos, coletados em poças de maré de praias de São Luis (São Marcos, Araçagi e Panaquatira): Lutjanus jocu (Família Lutjanidae) e Bathygobius soporator (Família Gobiidae). Os tecidos foram armazenados em etanol PA 100% e condicionados em freezer -20ºC até a extração do DNA. Cada amostra foi submetida a três métodos de extração de DNA diferentes: Método Salino modificado (Aljanabi & Martinez, 1997), Método do Fenol–Clorofórmio modificado (Sambrook e Russel, 2001) e por Kit comercial DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). A integridade e quantidade do DNA extraído pelos três protocolos foram analisadas mediante eletroforese em gel de agarose 0,8% (80 Volts por 60 min), corado com GelRed (Biotium), e visualizado em transiluminador de luz ultravioleta. A presença de uma banda espessa e com alto peso molecular foi usada como critério para a qualidade do DNA extraído. A quantificação de DNA das amostras (em ηg/µl) foi feita por comparação dessas bandas com um marcador que contêm concentrações de DNA conhecidas (Low Mass DNA ladder, Invitrogen).

RESULTADOS:

Quanto à quantidade de DNA, o método salino apresentou os melhores resultados (média de 148 ηg/μl). Entretanto, o método por Kit comercial apresentou melhor qualidade do DNA, sem degradação aparente e quantidade razoável (média de 66 ηg/μl). O método do Fenol-Clorofórmio mostrou níveis de degradação do DNA superiores aos outros dois procedimentos, resultando, portanto, em menor quantidade de DNA extraído (média de 59 ηg/μl). A eficiência do método salino, quanto à quantidade do DNA extraído, pode ter sido influenciada pela rapidez da extração, que foi realizada logo após as coletas, enquanto as extrações pelos outros dois métodos ocorreram quatro meses após as coletas. Este método universal, simples, de baixo custo e rápido, envolve um método seguro e de alto retorno, em termos de quantidade de DNA, podendo ser considerado um protocolo confiável. Embora o kit comercial da Qiagen também tenha apresentado bandas de DNA em quantidades utilizáveis, esta é uma metodologia de custo elevado, pois cada kit permite a extração de um número limitado de amostras. Diferentemente do relatado por vários trabalhos publicados, o método Fenol/Clorofórmio apresentou níveis maiores de degradação do DNA, o que pode ser explicado por alguma oxidação do DNA pelos compostos fenólicos.

CONCLUSÃO:

Foram observadas diferenças na qualidade e quantidade dos DNAs obtidos a partir dos três métodos testados. Neste estudo, observou-se o método salino e o kit comercial com melhores rendimentos. Porém, destes dois, o método economicamente mais viável é o salino, por ser simples, fácil, com um custo menor, embora o DNA por ele extraído possa apresentar menor pureza. Dessa forma, este é o método que foi escolhido para as extrações de DNA de peixes das várias espécies (dulcícolas e marinhas) estudadas no Laboratório de Genética Animal (GENEAL) da Universidade Federal do Maranhão, Campus de Chapadinha, pois ele tem fornecido DNA-molde para amplificação de diferentes marcadores moleculares usados para se estudar diversidade genética e sistemática molecular.

Palavras-chave: Purificação de DNA, Poças de maré, Peixes marinhos.