64ª Reunião Anual da SBPC

C. Ciências Biológicas - 3. Bioquímica - 1. Biologia Molecular

PROTEÍNA CATIÔNICA EOSINOFÍLICA: CLONAGEM E EXPRESSÃO DA PROTEÍNA COM EFEITO ANTITUMORAL

Priscila Oliveira de Lima 1 Paula Cristina Rabelo de Oliveira 1 Débora de Oliveira Lopes 1 Fábio Vieira dos Santos 1 Denise Tostes Oliveira 2 Michele Conceição Pereira 1

1. Universidade Federal de São João Del Rei - Campus Centro Oeste Dona Lindu, Divinópolis / MG 2. Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo - Departamento de Estomatologia, Área de Patologia - Bauru / SP

INTRODUÇÃO:

A proteína catiônica eosinofílica (ECP) é encontrada nos grânulos dos eosinófilos e apresenta atividade citotóxica contra células tumorais. Consiste em um peptídeo de 133 aminoácidos, com massa molecular de 15 a 22kDa, codificada pelo gene rns3, localizado no cromossomo 14q11.2. O efeito anti-tumoral dos eosinófilos associa-se à liberação das proteínas de seus grânulos, particularmente a ECP. Os objetivos desse trabalho foram a clonagem e a expressão da ECP em Escherichia coli.

METODOLOGIA:

O DNA genômico foi obtido de sangue periférico utilizando SDS/proteinase K, seguida de extração fenol/clorofórmio e precipitação com etanol. O fragmento de interesse foi amplificado por reação em cadeia da polimerase, em termociclador, utilizando primers específicos, os quais continham sítios de restrição para as enzimas BamHI e XhoI. Os mesmos foram confeccionados com auxílio do programa OligoPerfectTM Designer da Invitrogen Life Technologies (E.U.A). O produto de PCR purificado com o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, E.U.A), foi clonado em pCR®2.1-TOPO® e transformado em E. coli DH5α eletrocompetentes. O DNA plasmidial dos clones selecionados foi purificado utilizando o kit Wizard®Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation, E.U.A). O vetor de expressão pET-21a e os fragmentos de DNA foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e XhoI. Realizou-se a subclonagem em vetor de expressão pET-21a e transformação em E. coli BL21(DE3)pLysS eletrocompetentes. A expressão da proteína foi induzida por IPTG durante quatro horas e analisada por SDS-PAGE 12% e western blotting, empregando anticorpo primário monoclonal anti-histidina conjugado com fosfatase alcalina.

RESULTADOS:

A extração do DNA genômico possibilitou a obtenção de DNA puro, com rendimento adequado. Os iniciadores selecionados amplificaram adequadamente o fragmento de interesse. O produto da PCR apresentou tamanho concordante com o previsto (399 pares de base) e não apareceram bandas inespecíficas. A digestão total dos plasmídeos permitiu notar a presença de uma banda correspondente ao tamanho do vetor pCR®2.1-TOPO® linearizado sem o inserto (3,9kb) e a outra banda correspondente ao fragmento clonado (399pb), indicando o sucesso da clonagem. Na etapa de subclonagem, o vetor de expressão pET-21a cuja transcrição do gene heterólogo é controlada pelo forte promotor viral T7, foi transformado em E. coli BL21DE3 (pLysS), que possui o gene da T7 RNA polimerase no cromossomo. A análise da expressão de ECP recombinante por SDS-PAGE possibilitou visualizar uma banda entre 14.4kDa e 21.4kDa, correspondente ao tamanho de ECP recombinante, aproximadamente 16.3kDa, revelando sucesso no método de expressão empregado. A imunodetecção do polipeptídio de interesse não foi possível, devido a estocagem incorreta do anticorpo primário utilizado. As etapas de clonagem e expressão foram bem sucedidas e a massa molecular da proteína recombinante apresentou valor esperado.

CONCLUSÃO:

O protocolo de extração do DNA genômico permitiu a obtenção de DNA puro. Os primers utilizados foram específicos e adequados. A clonagem e expressão da proteína foram realizadas com sucesso. A massa molecular da proteína recombinante apresentou o valor esperado, cerca de 16.3kDa, porém a imunodetecção de ECP recombinante pelo western blotting não foi possível.

Palavras-chave: Proteína catiônica eosinofílica, Atividade citotóxica, Clonagem.